副猪嗜血杆菌编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的DNA疫苗构建及其免疫效力的研究.pdfVIP

副猪嗜血杆菌编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的DNA疫苗 构建及免疫效力研究 付书林1， 张敏敏1， 欧姬文1， 陈焕春1,2， 贝为成1,2 1.华中农业大学动物医学院 2.农业微生物学国家重点实验室，武汉，430070 摘要：研究结果表明编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的gapA基因广泛存在于15种标准血清型菌株中而且 基因序列比较保守，是一种很好的疫苗候选抗原。因此我们构建了GAPDH蛋白的DNA疫苗pCgap，并在小 鼠感染模型中评价了该DNA疫苗免疫反应和针对血清4型菌株MD0322和血清5型菌株SH0165的攻击所提 供的免疫效力。结果表明，DNA疫苗通过肌内免疫小鼠之后能够产生显著的抗体反应。而且产生的抗体具 有杀菌作用。DNA疫苗免疫小鼠7天之后能够在肌肉、肝脏、脾脏和肾脏中检测转录产物。IgG亚类分析 表明DNA疫苗可以同时诱导Th1和Th2型免疫反应，但是IgG1型免疫反应强于IgG2a型免疫反应。此外， DNA疫苗能够提供分别针对血清4型菌株MD0322攻击的保护率83.3％和血清5型菌株SH0165攻击的保护 率50％。免疫组免疫保护力显著高于阴性对照组和空白对照组。以上结果提示DNA疫苗pCgap为控制副猪 嗜血杆菌的感染提供一个新的策略。 关键词：副猪嗜血杆菌；GAPDH;DNA疫苗；免疫效力 国家农业行业科技国家生猪产业技术体系：第十四属全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会论文集 153 1材料与方法 1．1材料 1．1．1主要试剂 Adenine 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide 制性内切酶、LATaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNA TSA)、胰蛋白大豆肉汤(TrypticSoyBroth，TsB)购自美国Difco公司。 1．1．2菌株与质粒 Directional TOPO载体购自Invitrogen公司。 1．1．3实验动物 4-5周龄的雌性SPF级Balb／C小鼠购自湖北省疾病预防控制中心。 1．2方法 1．2．1DNA疫苗pCgap的构建 首先从副猪嗜血杆菌基因组中扩增基因gapA。所使用的引物为gapF2 (5’—GC盟△!￡cATGGC从TTAAAATTG一37：下划线，BamHI位点)and Directional 下划线，EcoRI位点)。PCR产物经过回收之后直接克隆至gpcDNA3．1TOPO载体中，然后转化TOPIO 菌株，挑取单菌落，振荡培养，提取质粒，用BamHI和EcoRI双酶切进行鉴定，构建质粒pCgap。 1．2．2 GAPDH蛋白表达的间接免疫荧光验证 FITC标记的羊抗鼠IgG37。C作用各30min，其间用1％的曲拉通100的PBS洗涤，与二抗反应后再用 l％的曲拉通100的PBS洗涤3次，直接于荧光显微镜下镜检。 1．2．3 DNA疫苗pCgap的免疫 后股大腿肌肉免疫100p 空白对照组。采用同样免疫方式和免疫剂量在第一次免疫之后的第14天和第28天再进行加强免疫。通过 尾静脉采集小鼠的血液，并分离血清，用作免疫学的测定。 1．2．4 pCgap免疫后PCR观察在组织中的分布 DNA疫苗pCgap第一次免疫小鼠之后第7天，采取每组小鼠的肌肉，肾脏，脾脏和肝脏，每组三只小鼠， BloodandTissue 然后用DNeasy 布情况。所用引物为gapFl和gapF2。 1．2．5 pCgap免疫后RT—PCR观察在组织中的分布 为了测定gapA基因在免疫组小鼠中的表达水平，各个实验组的小鼠的肌肉，肾脏，脾脏和肝脏在第 154 国家农业行业科技国家生猪产业技术体系：第十四届全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会论文集 Mini 一次免疫之后7天被采取，每组3只。用RNeasy 的DNAase进行处理，然后用作cDNA合成的模板。cDNA合成用cDNASynthesis 1．2．6 pCgap免疫后的抗体检测及亚类分析 稀释的血清在37℃孵育30min。加入HRP标记的兔抗鼠的I西，再在37C孵育30rain。为了测定IgG的亚类，