载体表达的siRNA分子对猪圆环病毒2型复制的抑制作用.pdfVIP

碉 微生物学报ActaMicrobiologicaSinica 48(11)：1507-1513；4November2008 ISSN0001—6209；CN111995／Q http：／／joumals．im．ac．cn 载体表达的siRNA分子对猪圆环病毒2型复制的抑制作用 王海燕，刘文博，高崧，刘秀梵 (扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室，扬州 225009) 摘要：【目的】寻找一种基于RNA干扰技术的猪圆环病毒 2型感染的防控方法。【方法 】根据猪圆环 病毒2型毒株基因组核苷酸序列，设计了3条特异性小干扰 RNA (shortinterferingRNA，siRNA) 分子，其中2条针对猪圆环病毒 1型和2型复制酶基因 (rep)，1条针对猪圆环病毒 2型核衣壳蛋白 基因(cap)，将合成的DNA片段退火形成双链 ，分别连接到 RNAi．ReadypSIREN．RetroQZsGreen载 体鼠源U6启动子下游，转化大肠杆菌得到阳性克隆，测序鉴定后分别命名为Retro．SH1，Retro—SH4， Retro．SH6。用上述质粒转染PCV2感染前、后的Dulac细胞及肌肉注射 PCV2感染前、后的BALB／c 小 鼠，应用实时定量 PCR试验评价其对病毒在细胞及小鼠体内复制的抑制作用，免疫组化法检测脾 脏中病毒的存在。【结果】感染PCV2前或后转染 500ngRetro—SH1，Retro．SH4，Retro．SH6质粒能 有效抑制PCV2在 Dulac细胞上的复制，抑制率最高可达 99％以上，对 10株不同来源的临床分离株 在细胞中复制的抑制作用同样明显，且不同毒株间差异不大。动物试验中，肌肉注射 10 g上述不 同siRNA分子对小鼠体内PCV2的复制有一定的抑制作用，其抑制率在 26％至 99％之间。【结论】 载体表达的siRNA分子可能成为防控猪圆环病毒 2型感染的一种新工具。 关键词：RNA干扰；猪圆环病毒2型；复制；抑制 中图分类号：R392 文献标识码 ：A 文章编号 ：0001—6209(2008)11-1507—07 猪圆环病毒2型 (porcinecircovirus2，PCV2)是当 或 1768个核苷酸，含有 2个主要的开放阅读框(open 前严重危害世界养猪业的重要病原之一。PCV2不仅能 readingflame，ORF)，其中ORF1编码病毒与复制有 引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎和肾病综合征 关的两种蛋 白Rep和 Rep’，这两种蛋白均为 PCV2 等诸多类型的疾病l【】，而且感染该病毒能导致免疫抑制， 病毒复制所必需，将Rep和Rep’蛋白进行突变，可降 造成继发感染2【】，给养猪业造成了巨大威胁。目前世界 低病毒 DNA 的复制，同时使病毒蛋 白的合成减少 上很多国家都有该病的发生。PCV2与其它病原体混合 90％以上。ORF2基因编码病毒的衣壳蛋白，是主要 感染的报道也越来越多，野猪群中也存在着PCV2感染 的结构蛋白，也是主要的免疫原性蛋白4【】。这两种蛋 和疾病的发生口l。目前对该病还没有理想的防制措施， 白的编码基因均可作为沉默的靶基因。 人们一直在寻求预防、治疗 PCV2感染的新方法，但由 RNA干扰 (RNAi)是由双链 RNA介导的在转 于PCV2在细胞中增殖不引起细胞病变，感染后会引起 录后水平特异地降解有同源序列基因产物的现象，故 免疫抑制，疫苗研究至今没有根本性突破，因此探索预 又被称为转录后基因沉默现象 5【1，是研究基因功能、 防和治疗PCV2感染的新方法显得尤为迫切。 肿瘤治疗、抗病毒感染的新型工具 】。目前，RNAi PCV2基因组为一单股环状 DNA，全长约 1767 技术在艾滋病病毒 (mv)、乙肝病毒 (rmv)、丙肝病毒 基金项 目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金(20O41