结构与性能 Chapter 2.ppt

第二章 蛋白质的理化性质及其分离和提纯 一、氨基酸的性质 两边取负对数： -lg [H+ ] 2 = - lg K1 － - lg K2 ∵ -lg [H+ ] = pH - lg K1 = pK1 - lg K2 = pK2 ∴ 2 pH = pK1 + pK2 令 pI为等电点时的pH，则 pI = ? （ pK1 +pK2） Gly：pI = ?（2 .4 + 9.6) = 5.97 由此可知: 等电点相当于该aa两性离子状态两侧  基团pK值之和的一半。 对侧链R基不解离的中性氨基酸： pI=1/2（ pK1+ pK2） 即：等电点pH值与离子浓度无关，只取决于兼性离子两侧基团的pK值。 对有三个可解离基团的氨基酸： 如：酸性氨基酸、碱性氨基酸的pI计算： a、先写出其解离公式； b、后取兼性离子两侧基团的pK值的平 均值。 如：天冬氨酸 如赖氨酸： 天然蛋白质分子的20种氨基酸，以色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有较强的光吸收。其吸收峰在280nm左右，以色氨酸吸收最强。 可利用此性质采用紫外分光光度法测定蛋白质的含量。 紫外吸收性受溶液pH的影响。 蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜 核糖核酸酶的变性与复性 盐析 分段盐析： 半饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较大的蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较小的蛋白。因此，使用不同浓度的硫酸铵溶液就可将分子量不同的蛋白质进行初步分离。 蛋白质分离提纯的一般程序 蛋白质的分离 蛋白质等电聚焦电泳 (isoelectric focusing，IEF) 亲和层析——金属螯合层析(Metal Chelating Chromatography) 利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法。 蛋白质的分子量测定 三、蛋白质分离提纯的一般原则 关于蛋白质我们已知什么？ 如果一个蛋白质过去已从不同的来源纯化得到，它的很多信息可应用到新来源的蛋白质。例如：分子的大小、定位、等电点、疏水性及翻译后的修饰等，应该保持相同。如果蛋白质是一个酶或受体，则根据该蛋白质与底物或配体的关系可以制定出一个成功的纯化策略。 蛋白质需要有多纯？ 蛋白质纯化的程度通常取决于它最后的用途。如果蛋白质是供研究用的，则它应该是非常纯的，如果蛋白质是用于工业的，部分纯化就足够了。 纯化蛋白的量要多少? 对于活性研究用的，只需要比较少量的活性蛋白质；而对于进行结构研究用的蛋白质来说，则需要比较大量的高纯度蛋白质。 蛋白质应该如何进行鉴定? 在蛋白质纯化过程中，为了进行蛋白质的追踪，必须有一个快速、重复性好而且灵敏的鉴定方法。此鉴定方法还应该是经济的，能在小体积下进行操作，而且不要求采用昂贵的仪器。 纯化时间应该多长? 纯化步骤应该很快，以减少蛋白质活力的丧失和蛋白质降解等。一般来说．蛋白质的量在纯化过程的各步中均会有损失，因此应当尽量减少纯化步骤，以期获得最大的产率。 ????????? 一般程序可分为前处理、粗分级和细分级三步： 前处理：分离提纯蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不至于丢失其生物活性。 不同的组织或细胞可用不同的方法破碎； 组织或细胞破碎以后，选择适当的介质（一般用低浓度的缓冲液）把所要的蛋白质提取出来。 有时在肌肉组织中抽提时也用稀碱（肌肉中含有乳酸）； 在提取膜蛋白或包含在体内的蛋白质时，可加入表面活性剂以增加溶解度。 由于在细胞中普遍存在各种蛋白质水解酶，有时需低温操作和加一些相应的蛋白酶抑制剂、螯合剂可防止蛋白质的降解。 粗分级：当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白质分离开来。 一般这类的分级用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。 特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。 细分级：样品的进一步提纯。一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。 必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦电泳等作为后续的提纯步骤。 结晶：蛋白质分离提纯的最后步骤。 尽管结晶并不能保证蛋白质的均一性，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯，而重结晶又可除去少量的夹杂蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不