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利用流式细胞仪分析细胞存活率、细胞周期、ROS （以6 孔板为例） 测定细胞存活率 5 1. 取对数生长期的细胞,以4 ×10 / ml 密度接种于6 孔细胞培养板上； 2. 培养过夜后，用于相应实验处理； 3. 收集处理后的细胞培养液至流式专用管； 4. 加1ml PBS缓冲液清洗一次，清洗液加入管中； 5. 胰酶消化收集细胞于上述管中； 6. 1ml PBS缓冲液清洗剩余细胞一次，清洗液加入离心管； 注：3－6步都收集于同一流式专用管。 7. 800 g离心6 min ，去上清； 8. 加1 ml PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清； 9. 最后重悬细胞于500 l含5 g/ml碘化丙啶(propidium iodide, PI)的PBS缓冲液 中； 10.避光冰上孵育10 min,用流式细胞仪测定细胞存活率； 11.PI可结合DNA，在一定波长的激发光作用下可发出荧光，其强度与DNA含量成 正比，但其不能透过完整的细胞膜。而FS （前向散射）则是指示细胞大小的 参数。因此，我们以FS为横坐标，PI的荧光值的对数 （log PI）为纵坐标， 就可将不同大小和不同荧光强度的细胞区分开：活细胞表现出较大的FS值和 较弱的荧光强度；坏死的细胞碎片，由于丢失部分DNA，具有较小的FS值和 较弱的荧光性；凋亡细胞的细胞膜具有通透性，细胞虽然聚缩变小，但核保 持完整，所以显示出较小的FS值和较强的荧光强度。通过计算活细胞占所有 细胞的百分率，即可得知细胞存活率。 测定细胞周期 1. 细胞的处理及收集同测定细胞存活率方法的第1-8步； 2. 用300 l 的PBS 重悬细胞，将细胞逐滴加入700l 预冷的无水乙醇中，乙醇 终浓度为70%，4 ℃避光固定过夜； 3. 800 g 离心10 min ，去上清； 4. PBS 清洗两次； 5. 重悬细胞于500 l 含100 unit/ml RNaseA 的PBS 缓冲液中，避光37℃孵育 30 min ； 6. 加2 mg/ml PI 至终浓度50 g/ml，避光孵育30 min ， 7. 以PI 荧光读数为横坐标，细胞数为纵坐标，在流式细胞仪上计数细胞周期 各期的细胞数目。 测定胞内ROS的积聚 1. 细胞的处理及收集同测定细胞存活率方法的第1-8步； 2. 重悬细胞于1ml 的PBS 缓冲液中； 3. 加荧光探针如CM-H2 DCFDA （主要检测H O ，1 mol/ml ），37℃孵育30 2 2 min ； 4. 在流式细胞仪上以FS和SS （侧向散射，指示细胞光透射程度）为参数，选 取活细胞 （大FS值，较小SS值），将其限定在Gate 内，对Gate 内的细胞 进行ROS 的分析。以相应荧光探针荧光读数的对数为横坐标，细胞数为纵坐 标即可测定活细胞的ROS 的相对强度。