磷酸化蛋白质的分析方法.docVIP

磷酸化蛋白质的分析方法 试剂： 乙腈(Acetonitrile，ACN)，三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA) 购自 Merck 公司(Darmstadt，Germany)。尿素(urea)，氯化钠(Sodium chloride，NaCl)购自Sigma 公司。甲酸(Formic acid，FA)、乙酸(Acetic acid，HAC)购自Aldrich(St. Louis，MO，USA)。盐酸胍(Guanidine hydrochloride，GuCl)，二硫苏糖醇 (dithiothreitol，DTT)，碳酸氢铵(Ammonium bicarbonate)，碘乙酰胺(Iodoacetamide，IAA) 购自Bio-Rad (Hercules，CA，USA)。胰蛋白酶(Trypsin)购自Promega (Madison，WI)。所有的化学品的纯度级别除了乙腈是色谱纯外都是分析纯。实验所用水都经过Milli-Q system (Millipore，Bedford，MA，USA)处理。 样品制备 样品用2D 裂解液裂解（8 M Urea,4% CHAPS,65 mM DTT,40 mM Tris），100W 30 s 超声后，15,000g 离心45 min。取上清，Bradford法定量；取500μg 样品加入2ul 1M DTT，于37℃还原反应2.5h；再加入10ul 1M IAA 于室温避光烷基化40min。100%丙酮沉淀过夜，100mM碳酸氢铵（pH 8.5）溶解样品，按50：1加入胰蛋白酶酶解过夜。 磷酸化多肽的富集： Loading buffer: (饱和glutamic acid/65%乙腈/2%TFA) Wash buffer 1: (65%乙腈/0.5%TFA) Wash buffer 2: (65%乙腈/0.1% TFA) Elute buffer 1: (300mM氨水/50%乙腈) 1．100ul loading buffer 平衡TiO2 column； 2. 200ul loading buffer溶解样品(2mg)； 3.loading sample 到TiO2 column； 4. 100ul loading buffer wash TiO2 column； 5.100ul washing buffer 1 wash TiO2 column； 6. 100ul washing buffer 2 wash TiO2 column； 7. 100ul Elute buffer wash TiO2 column,收集Flow through ,冻干，准备MS分析。 质谱分析 Surveyor 液相色谱系统与轨道线性离子阱 (Orbi-Trap，Thermo Electron，San Jose，CA)联用进行一维质谱鉴定。使用的反相色谱柱为75 μm×15 cm，填料为C18(Column Technology，USA)。经过色谱柱的流速经过分流后为200 nL/min。 使用120 分钟的梯度洗脱酶解肽段，从2%到35%缓冲液B (0.1% 甲酸的乙腈溶液)。Orbi-trap 离子传输毛细管的温度为160 °C。Nano 喷针电压为1.85 kV，碰撞能量为35%。离子阱内的离子数由AGC(automatic gain control)自动控制。一级质谱的扫描范围为400到2000 m/z，二级质谱通过data-dependent 模式触发，选择强度在前十位的离子进行二级质谱分析。动态排除的时间为1.5 min，30 s 内重复两次。 搜库： 液相色谱-串联质谱iquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)获得的MS/MS数据采用Mascot2.2程序搜索。参数设置为：蛋白酶为胰蛋白酶，最大允许丢失的酶切位点为1个，静态修饰选为半胱氨酸的羧氨甲基化，动态修饰选为丝、苏、酪氨酸的磷酸化(+79.98 Da)。母离子质量误差设为200ppm,碎片离子的质量误差范围为±1 Da。 我们产生正反库,数据格式由原始的氨基酸序列(正库)与逆向的氨基酸序列(反库)组成，目的是为了方便对数据的质量评价。搜库结果使用实验室编写的软件进行整合，最终的筛选标准为磷酸化修饰肽段的假阳性率(False positive rate，FPR)均小于1%，母离子误差为10ppm。