双重荧光实时定量RT-PCR+检测前列腺癌患者外周血DD3+mRNA+和PSA+mRNA+的初步临床应用.pdfVIP

双重荧光实时定量RT-PCR 检测前列腺癌患者 外周血DD3 mRNA 和PSA mRNA 的初步临床应用 1 1 1 2 1 林晓梅 许 刚 吴 伟 陈 伟 陶志华 2 1 3 1 2 翁志梁 陈凤萍 吴秀玲 陈晓东 李澄棣 温州医学院附属第一医院 1 实验诊断中心 2 泌尿外科 3 病理科 325000 前列腺癌 prostate carcinoma, PCa 是男性生殖系统常见的恶性肿瘤 在西方国家占癌症死亡率的第二位 近 年来我国的前列腺癌的发病率也呈上升趋势 前列腺癌主要通过血道向远处转移 因此血液中微转移癌细胞的检测 对于前列腺癌的微转移诊断 疗效观察及预后判断均具有重要意义 本研究利用TaqMan探针技术建立双重荧光实时 定量RT-PCR方法对前列腺癌 PCa 患者和良性前列腺增生 BPH 患者外周血DD3 mRNA和PSA mRNA 同时进行 定量检测 并对两者的初步临床应用价值进行探讨 材料和方法 1 主要试剂及仪器 LNCaP 细胞游中科院上海细胞所提供 总RNA 抽提试剂盒 TaKaRa Biotechnology 公司 cDNA 第一链合成试剂盒 立陶宛Fermentas 公司#K1622 Taq DNA 聚合酶 dNTP 立陶宛Fermentas 公司 3K18 型低温离心机 德国Sigma 公司 Mastercycler PCR 仪 德国Eppendorf 公司 DU 800 紫外分光光度仪 美国Beckman 公司 ABI 7000 PCR 仪 美国ABI 公司 CEQ8000 DNA 测序分析仪 美国Beckman 公司 H6-1 微型电泳仪 上 海仕博公司 2 对象 本院2004 年10 月至2007 年2 月门诊或住院病例 PCa 组49 例 年龄57 94 岁 平均75 岁 Jewett 临床分期B 期10 例 C 期15 例 D 期24 例 Gleason 评分 2 4 分7 例 5 7 分16 例 8 10 分26 例 良性前 列腺增生 BPH 组71 例 年龄53 86 岁 平均69 岁 其中35 例PCa 患者经发射式计算机断层显像 emission computed tomography ECT 检查 22 例出现骨转移病灶 ECT 阳性组 13 例未见明显骨转移病灶 ECT 阴性组 PCa 和BPH 患者均在直肠指检前或后1 周和活检前抽取外周静脉血5ml 所有病例均经病理组织学证实 本研究经医院 伦理委员会审批并获得所有研究对象的知情同意 3 引物和探针 依据GenBank 收录的PSA mRNA 全序列 M26663 利用Express2.0 软件设计其引物和探针 DD3 mRNA 引物和探针参照文献 所有引物和探针均由上海基康公司合成和标记 PSA mRNA 上游引物为 5-GGG TCCCGGTTGTCTTCCT-3 下游引物为 5-ACTCCCAGCCTCCCACAATC-3 探针 5- HEX -CAATCCACGTCA CGGA- MGB -3 DD3 mRNA 上游引物为 5-TGGTGGGAAGGACCTGATGA-3 下游引物为 5-TGTGTGGCCTCA GATGGTAAAGT-3 探针 5- FAM -ACAGAGGTGAGAAATAA - MGB -3 4 外周血单个核细胞分离 总RNA提取和cDNA合成 1 将患者5ml静脉血用EDTA-Na 抗凝 于4 用淋巴 2 细胞分离液 天津灏洋生物制品科技有限公司 分离单个核细胞 并收集至1.5 mlEppendorf管中 加