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真核载体构建与表达 载体构建步骤 Get the target DNA sequence Select appropriate vector PCR primer design Obtain cell or tissue PCR amplification Restriction, ligation and transformation Screen positive clone Sequencing 获取目的基因序列 载体的选择 克隆载体 T载体 Topo T载体 普通表达载体 克隆载体 T载体 Topo T载体 普通表达载体（plasmid） pCDNA3.1 (non fusion or fusion) pCI-HA (fusion with HA tag) pRK5-FLAG (fusion with FLAG tag) pFLAG-CMV (fusion with FLAG tag) pEGFP-C1/N1 pIRES2 -EGFP 引物设计 Restriction sites The same ORF with fusion partner Protective residues PCR扩增 DNA polymerase Rich GC sequence Nest PCR 限制性内切酶 连接 PCR product:vector ~ 10:1 At 25 °C for 2-3 hours or at 16 °C overnight Inactive T4 DNA ligase (at 70 °C for 10min ) 转化与鉴定 感受态细胞 酶切鉴定 PCR鉴定 测序 抽提质粒与转染细胞 少量与大量制备质粒 选择转染试剂 瞬时转染 稳定转染细胞筛选 鉴定 RT-PCR Northern Blot Western Blot Function 相关软件 引物设计（primer 5.0、Oligo 6） 序列比较（DNASTAR、Omiga） * * 2006-6-23 *
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