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细胞培养技术 药物科学和技术学院 细胞生物学 周立军 上次课内容细胞培养的基本知识 一、绪论 培养法的种类、培养法的发展、细胞培养的常用术语、培养细胞的作用及意义、培养法的应用 二、培养细胞的特征 培养细胞的生长方式和类型、 培养细胞的生长特点和生长增殖过程、 细胞培养的条件及影响因素 一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、显微操作技术 —、光学显微镜 （一）普通光学显微镜 1. 构成： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。 显微镜的几个光学特点： 介质折射率越接近镜头玻璃的（ 1. 7 ）越好； sin α /2的最大值小于1；油镜介质为香柏油，镜口率可接近1.5； 普通光线的波长为400~700nm，光镜分辨力约为0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。 （二）荧光显微镜 Fluorescence microscope 特点：光源为短波光； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。 用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。 （三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描； 能显示细胞样品的立体结构； 分辨力是普通光学显微镜的3倍； 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。 （四）暗视野显微镜 dark field microscope 聚光镜中央有挡光片，视野背景是黑的，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的。 可观察 4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。 （五）相差显微镜 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。 用途：观察未经染色的玻片标本。 （六）偏光显微镜polarizing microscope （七）微分干涉差显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC） （八）倒置显微镜 inverse microscope 物镜与照明系统颠倒； 用于观察培养的活细胞，通常具有相差或DIC物镜，有的还具有荧光装置。 （九）当代显微镜的发展趋势 二、电子显微镜 （一）透射电子显微镜 transmission electron microscope, TEM 1. 原 理 表二、不同光线的波长 （三）扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM 三、显微操作技术micromanipulation technique 小 结 一、细胞培养的必备设施 无菌实验室、超净工作台、恒温培养箱、其他设备 二、细胞培养常用器材及处理方法 玻璃器材、塑料器材、橡皮器材、金属器材、其他用品 三、显微技术及设备 （二）平衡盐溶液 （三）消化液 原代培养分散组织细胞 胰蛋白酶液：使细胞间蛋白质水解， 细胞分散 EDTA（二乙烯四乙酸二钠）： 吸取Ca2＋，Mg2＋，使细胞分离 胶原酶 原代培养分散组织细胞 培养基（液）是维持体外细胞生存和生长的溶液 天然培养基： 合成培养基：氨基酸、维生素、糖类 无机离子、其它成分 无血清培养基： （一）天然培养基 天然培养基有生物性液体（血清）， 组织浸液（胚胎浸液），凝固剂（血浆） 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点： 来源受限。 成分复杂，影响对某些实验产物的提取 和实验结果的分析。 易发生支原体污染 血清(serum)： 一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它动物血清。 外观：透明淡黄色，无溶血，无沉淀。 灭活：56度，30min消除补体活性。 成分： 总蛋白3.5-4.5g/100ml 球蛋白不高于2g/100ml 关于血清的几个问题 血清必须贮存于–20 ～ -70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45 ml分装于无菌50ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器