生物信息学论文 胡小鹏.docVIP

深圳大学考试答题纸 (以论文、报告等形式考核专用)二○ 一 一 ～二○ 一 二 学年度第 2 学期 课程编号课程名称 生物信息学 主讲教师 苏庆宁 李凌云 买制刚 评分 学 号 姓名 专业年级 2012级生物医学工程（医） 教师评语： 题目： 小鼠肿瘤坏死因子α启动子荧光素酶表达载体的构建 摘要：利用NCBI genebank数据库及genetool软件设计引物，克隆小鼠TNF-α启动子序列，将其插入荧光素酶表达载体pGL3-basic中。将经过鉴定的重组载体pGL3-TNFα-promoter转染巨噬细胞264.7，应用萤光素酶检测系统检测其活性。 1.查找启动子序列： 打开NCBI的Map viewer网站，网址/mapview/index.html，输入要查询的TNF-α，得如下结果： 再点击右下方quick filter 勾上gene选项，找到TNF-alpha基因所在染色体上的位置： 点击17号染色体上的Genes seq（注：下边的几个序列也是一样的，一般选第一个即可）出现如下信息： 点击，Download/View Sequence/Evidence，查看基因序列： Sequence Format 选择Genebank 形式，再点击Display,出现：目的基因的相关序列以及信息。 可知转录位点从基因1956位开始转录，由于内含子的存在，所以mRNA在DNA上序列上分成了几段。promoter位于转录起始位点上游约2000bp区域，启动子序列为： 引物设计 用NCBI查出小鼠TNF-α的基因的CDS： 打开网站：/NEBcutter2/index.php，查询在这段开放阅读框内0 cutter的酶，并结合结合实际情况，使用列表中的XhoⅠ 、HindIII 用genetool软件设计引物： Forward Primer Name: TNF-α deg 1-21 Len:21 Score:76* Predicted Melting Temperature: 58 degrees Celsius GeneTool Score: 76 Start: 1 End: 21 Length: 21 Bases: 5CCAATTCTCGAGGTTTTCCGAGGGTTGAAT 3 Reverse Primer Name: TNF-α deg 1934-1956 Len:23 Score:74* Predicted Melting Temperature: 51 degrees Celsius GeneTool Score: 74 Start: 1934 End: 1956 Length: 23 Bases: 5CCATAAAGCTTGAGGGAGATGTGGCGCCT 3 上游加入XhoⅠ酶切位点（）5CTCGAGCCCAATTCTCGAGGTTTTCCGAGGGTTGAAT 3 下游引物P2 5端加入HindIII酶切位点（AAGCTT5AAGCTTCCATAAAGCTTGAGGGAGATGTGGCGCCT3 请外面引物公司合成，扩增基因片段长度为：233bp。 基因组DNA提取 按组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒说明提取小鼠基因组DNA。-20℃保存备用。 以基因组DNA为模板，用引物扩增TNF-α启动子DNA序列。 MWM:DNA marker 1:PCR产物，大小为bp 图1。TNF-α启动子序列PCR产物 MWM:DNA marker 1:重组质粒pGL3-TNFα-promoter 图2.限制性内切酶双酶切图 6.基因测序结果： 7.转染及荧光素酶活性检测 实验组将pGL3-TNFα-promoter+pRL-SV40（转染效率内参），对照组pGL3-basic+pRL-SV40分别用脂质体Lipofectamine 2 000瞬时转染巨噬细胞264.7。实验组、对照组各24孔。转染36 h后，按照双荧光素酶检测试剂盒（Dual Luciferase Assay System）的操作说明处理转染细胞，并通过GloMax 20/20发光检测仪测萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶的荧光值， 将两者的比值，作为衡量荧光素酶活性的依据。 Reference: LIU B.Construction and identification of human puma promoter luciferase report gene vector[J].Medical Journal of National De-fending Forces in Southwest China,2009,19(1):42-44. 2.欧阳