UPPCR结合RFLP快速检测体液标本中病原菌的初步研究和应用.pdfVIP

维普资讯 药 品 趁 验 y t p 一． 0 青 岛大学医学院I266012) 闫志勇 王斌 摘要 目的 建立通用 引物聚 菌 16srRNA基 因兼有保守性和变 落分别接种于 5mLLB 中，37℃摇 合酶链反应 (uP—PCR．)结合 限制 异性的特点，建立了通用引物聚合 床过夜 ，取 1．0mL用 DNA提取试 性酶切片段长度多态性 (RFLP)酶 酶链反应 (uP —PcR)以快速检测 剂盒按说明书提取。体液标本接种 切 图谱 的方法 ，快速检测临床体液 体液标本中的病原菌的方法，并对 至 5mLLB液体培养基中37℃摇床 标本 中常见病原菌 。方法 根据体 限制性片段长度多态性 (RFLP)鉴 振荡培养 2h，后提取细菌DNA。 液标本中常见病原菌 16SrRNA基 定细菌 的应用进行 了初步探讨 ，现 1．5UP —PCR扩增 取上述菌 因保 守区设 计 的通 用 引物进 行 将结果报告如下。 株 DNA模板 1uL，引物 UP1、UP2 UP—PCR扩增 ，确定标本是否有细 各 1．5laL，4xdNTP 2．5|lL，10X 菌感染，然后对阳性标本的扩增产 1．材料和方法 PCR 缓冲 2．5laL，Taq酶 0．4|lL， 物进行 RFLP分析 ，进一步鉴定细 1．1标本来 源 2000年 7月～ 加水补足至总体积 25|lL混均后 菌。利用该方法对 204例体液标本 2002年 12月青岛市市立医院、青 进行扩增；扩增循环参数：94qC预变 进行 了检测 ，并与常规细菌培养鉴 岛大学医学院第一、二附属医院共 性 6min后，94℃ lmin，54℃ 1min， 定法进行 比较 。结果 uP —PCR所 收集体液标本 204份 ，其 中脑脊液 72oC2min，25个循环后 72℃延伸 有细菌均产生 1032bp，扩增产物经 102份 ，血液 52份 ，胸腹水 32份 ， 10min．同时 以高压灭菌 的双蒸水 RFLP法可将细菌进行鉴别。204份 其他体液标本 18份 。每份标本 3～ 作为阴性对照，扩增完成后 10％琼 体液标本 的检测 中，与培养法相 5mL，平均分为 2份，以备鉴定。 脂糖凝胶 电泳。 比，其灵敏度 、特异性、阳性预测 1．2对照菌株 以金黄色葡萄 1．6RFLP鉴定 用 PCR 产物 值 、阴性 预 测值 分别 为 95． 、 球菌 (ATCC25923)，表皮葡萄球 纯化试剂盒纯化 回收在各标准对 88．6％、88．0％和 99．4％。结论 该方 菌 (ATCC12228)，等 18株脑脊液 照菌株及体液标本 UP —PCR 阳性 法具有敏感 、特异 的特 点，可广泛 中常见病原菌的标准株作为对照 扩增产物 ，在 20|lL酶切体系 中， 应用于临床体液标本中病原菌 的 菌株 。 将 1．0laL的PCR．产物用 HaelII在 快速检测 。 1．3主要试剂及其处理 DNA 适 当的酶切缓冲液 中酶切 ，反应体 关键词 病原菌 聚合酶链反 提取试剂盒 、PCtL产物纯化试剂 系参照说 明书 。在推荐的温度下作 应 限制性酶切 图谱 16SrRNA基 盒、HaelII等限制性 内切酶为美国 用 2h后 ，1．2％聚丙烯凝胶 电泳 ，硝 因 Promega公司产 品；TaqDNA聚合 酸银染色后观察 ，进行 比较分析 以 临床 中体液标本感染病原菌 的 酶购 自加拿大 MBI公司。除Taq酶 进一步鉴定细菌 。对有相 同HaelII 种类多，病情 比较复杂，因此，快速 外，所有PC1L试剂均经过高压灭 酶切 图谱 的细菌 ，再分别选用 Mnl 检测和鉴定这些标本 中感染的病原 菌或用 0．20|lm滤菌器抽滤 。uP — I、uI等 限制性 内