灵芝多糖对细胞因子诱导的杀伤细胞的影响和作用机制研究.pdfVIP

2004灵芝专题研讨会 灵芝多糖对细胞因子诱导的杀伤细胞的影响及 作用机制研究 祝晓玲林志彬 3 北京大学医学部基础医学院药理系北京10008 实验目的：获得增殖力强、细胞毒活性高的杀伤细胞是过继免疫疗法成功的关键。 首次研究一定浓度的灵芝多糖体外作用，对细胞因子诱导的杀伤细胞 killer (cytokine．induced NO、IL．2分泌水平、穿孔素、颗粒酶蛋白及rnRNA表达的影响，通过受体阻断 实验首次研究灵芝多糖在CIK细胞膜上受体作用途径，并观察灵芝多糖和细胞因 子联合使用时的协同作用。 实验方法：(1)体外实验：CIK细胞制备：C57BL／6j雄性小鼠非粘附性脾细胞 1×106／ml，加IFN．Y(终浓度为1000U／m1)，培养24小时后，加rlL．2(终浓度为 300 U／m1)、抗CD3单抗(终浓度为50ng／m1)、rlL．1(终浓度为100U／m1)培养。每 3天检测细胞密度，用含IL。2的新鲜完全培养基换液，在增殖初期第3～9天较低 14～21天，即为CIK细胞。上述方法制备的CIK细胞为标准组作为阳性对照，筛 选出的两个灵芝多糖有效药物浓度与细胞因子最佳组合为药物组1、药物组2， 用相应浓度的可溶性淀粉、甲基纤维素代替灵芝多糖作为阴性对照。检测各组CIK 细胞的增殖力、细胞毒活性、效应细胞表型；加入多糖前，先加抗CR3抗体作用 半小时后培养CIK细胞，进行多糖受体阻断实验，分析CIK细胞增殖力、细胞毒 测NO，Westem ml／ 内实验：荷瘤动物模型建立：分别取S180、H．22肿瘤细胞株5x106／ml，0．2 只接种于右腋皮下或腹腔内。荷瘤小鼠分为标准CIK细胞治疗组、CIK药物组1 细胞治疗组、CIK药物组2细胞治疗组、标准LAK细胞治疗组、生理盐水注射 7静脉注射 组，另设正常对照组。接种瘤细胞后d3、d7、d10、d14效应细胞1xlO x10 S180荷瘤小鼠；效应细胞17腹腔注射H。22荷瘤小鼠。观察体重、瘤重、腹 围、抑瘤率、生命延长率。 52 2004灵芝专题研讨会 实验结果：灵芝多糖400“g／“或100¨∥ml和细胞因子有协同作用，可降低IL．2、 anti．CD3用量，不影响CIK细胞增殖和细胞毒活性，而阴性对照组细胞增殖力、 细胞毒活性明显降低。灵芝多糖药物组的CIK细胞表型和标准组比较无明显差 各组未检测到NO分泌；和标准组比较，灵芝多糖药物组CIK细胞培养上清中 TNF水平无明显差异，阴性对照组TNF水平降低；灵芝多糖药物组IL．2水平低 于标准组，高于阴性对照组；各组IFN-7水平无明显差别。CIK细胞杀伤靶细胞 过程中，各组NO分泌极低无明显差别；和标准组比较，灵芝多糖药物组TNF水 平无明显差别，但高于阴性对照组；各组未检测到IFN-y。受体阻断实验表明， 抗CR3抗体部分(60％～70％)阻断灵芝多糖的作用。和标准组比较，药物组CIK 细胞穿孔素、颗粒酶蛋白表达水平无明显差别，高于阴性对照组。CIK细胞过继 免疫疗法对S180、H．22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用均大于L镦细胞。与标准CIK细 胞治疗组比较，药物组CIK细胞抗肿瘤疗效无明显差别。