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动物 DNA 限制性片段长度多态性分析 9.1 动物 DNA 限制性片段长度多态性基本概况 DNA 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，简称 RFLP） 是进行动物物种分化和群体遗传多样性研究的一项重要经典技术，而线粒体 DNA 和核糖体 DNA 则是动物 RFLP 研究中最为常用的两种遗传标记（Nei，Tajima 1981）。 动物线粒体 DNA 是一种共价闭环的环状双链 DNA，具有严格的母系遗传方式，每个细胞中有 1 000～10 000 个拷贝，容易从组织中分离、提纯（Brown 等 1979；Avise 等 1983；Lansman 1983）。提取线粒体 DNA 的实验技术比较简单，且重复性好（王文，施立明 1993）。mtDNA 的基 因结构比较简单、稳定，分子量小（15.7～19.5kb），处于限制性内切酶分析范围，因此易于进 行结果分析（Brown 1979）。在脊椎动物中，mtDNA 无组织特异性，即个体内的线粒体 DNA 具有 高度的均一性（Avise 等 1983），这就有利于限制性内切酶分析。更为重要的是，mtDNA 进化速 度快，是单拷贝核 DNA 的 5～10 倍，因而是进行近缘种间和种内群体间分化关系研究的良好遗 传标记（Brown 等 1979，1983；Wilson 1985；Avise 1986；Harrison 1989）。生物多样性研究 中基本保护单元进化显著性单元（evolutionary significant units，简称 ESUs）（Ryder 1989）的确定，就极大地依赖于不同动物群体线粒体 DNA 单倍型的系统发育关系 （Moritz 1994）。 ESUs 的定义为：在 mtDNA 单倍型上互为单系群（monophyly）、在核基因座位上等位基因频率有 显著差别的群体即称为 ESUs。强调 mtDNA 的互为单系群，不仅因为它在进化上的重要性，而且 因为理论上和模拟实验均说明隔离群体在一定时间后能达到这种状态。生物 ESUs 已被证明是一 个在保护中很有用的概念标准。例如，在我们最近的一项研究中，发现广西的白头叶猴 Trachypithecus francoisi leucocephalus）和黑叶猴（T．f．francoisi）在 mtDNA 序列上 （ 严格地互为单系群（Wang 等 1996），这明确地说明了白头叶猴是保护中应受到重视的一个 ESUS 。 核糖体 DNA（ribosomal DNA，简称 rDNA）是一类中等重复的核内 DNA 序列，每个重复单 元（repetype）由非转录间隔区（non-transcribed spacer，简称 NTS）、转录间隔区（internal transcribed spacer，简称 ITS）和 3 种 RNA（18S RNA，5.8S RNA，28S RNA）基因编码区 组成。这 3 个区域的 DNA 序列有不同的进化速率，编码区非常保守，适合于构建生命系统树的 基部分枝；转录间隔区则中度保守，适合于推断 50×106 年前左右的事件；非转录间隔区则进 化速度较快，适合于种间和已有隔离的群体间关系的研究（Appels， Honeycutt 1986； Hillis，Davis 1986；Suzuki 等 1990）。此外，rDNA 以一种协同的方式进化，在个体内和群 体内有着较好的均质性（homoplasmy）。因此，有人认为，少量个体的抽样就能有效地代表 本章作者：王 文，陈永久，兰宏 110 遗传多样性研究的原理与方法 其来源群体 DNA 的变异情况（Dover，Coen 1981；Hillis，Davis 1986）。rDNA 重复单位的大小 还正好在 RFLP 易于检测的范围之内（Kominami 等 1981；Hillis，Davis 1986）。上述特点使 rDNA 成为动物遗传分化研究中一个有用的核内遗传标志（Hillis， Davis 1986；Suzuki 等 1990a， 1990b；兰宏等 199