大肠杆菌—链霉菌穿梭载体的构建及应用.pdfVIP

维普资讯 6一 l4 卷 1期 生 物 工 程 学 报 V0f．14No 1 1998年 1月 Chinese1ournM ofBiozechnology January1998 大肠杆菌．链霉菌穿梭载体的构建及应用 盔 ·龃圭 V邓子新 孕季伦 (华中农业大学生命科学技术学院 武汉 430070) (中国农业太学生物学院 北京 1000941 摘 要 pU6021和 pU4123是链霉菌的高拷贝表达载体，它们携带有受硫链丝菌素诱导的 强启动子 P 。分别在它们的台适位点插八大肠杆菌质粒的复制子和在大肠杆菌中选择用 的抗性标记基因(bta)，得到了两个能在大肠杆菌和链霉菌中穿梭复柳、并保持结构稳定的链 霉菌表达载体 ：pHZ1271和pHZ1272。将透 明颤菌 (Vitreoscilliasp)血红蛋白基因(vhb)克 隆到pHZ1272中．用它转化变铅青链霉菌(Streptom2~ceslividans)，经Westernblotting分析和 CO结台实验表明．在变铅青链霉菌中表达出了有生物活性的透明颤菌血红蛋白．从而证明 所掏建的pHZ1272载体具有在链霉菌中表达外源基因的功能。 关键词 链霉苗．大肠杆菌．穿棱载体，血红蛋白基因表达 学科分类号 Q782 链霉菌作为基因表达的宿主，在表达和分泌有活性的蛋 白质方面 已显示出优越性。 但是在链霉菌基因表达的研究方面，可供选择用于基因表达的含严谨控制型启动子的质 粒载体仍十分有限。最近，Takano等人构建了高拷贝的链霉菌基因表达载体pU6021和 pJJ4123，并利用p[16021在变铅青链霉菌(Streptorayceslividans)中成功地表达出在淡青 链霉 菌 (Streptoraycesglaucescens)中参与 tetraeenomyein聚酮台成 的 B．酮酰 台酶 K (TcmK)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)的十一烷基灵菌红素基因簇 中的正调节 蛋白(RedD)，和比目鱼生长激素(FGH)J。 由于链霉菌质粒载体DNA操作 比较困难，因此我ff]g~pU6021和 pIJ4123进行了相 应的改造，使之成为大肠杆菌．链霉菌穿梭载体，以利于在链霉菌中表达外源基因的体外 操作试验。 本文报道大肠杆菌一链霉菌穿梭载体pHZ1271和pHZ1272的构建以及应用pHZ1272 在变铅青链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白基因的研究结果。 1 材料和方 法 1．1 质粒殛菌株 链霉菌表达载体 pIJ4123和 pIJ6021[ (英 国J。hnInnes中心赠)；质粒 pUC18和 pUC19，大肠杆菌DH5a和JM109，以及变铅青链霉菌JT46(均本室保存)；携带有透明颤 菌vhb基因的质粒pRK404一vhb(由中科院上海生物工程中一t；-扬胜利教授提供)；Vhb抗体 国家 自然科学基金和国家教委资助课题。 收穑 日期：199705．c】H，修 回日期：1997—0826。 维普资讯 1期 杨闰英等：大肠杆菌．链霉菌穿棱载体的掏建及应用 7 (本室制备)。 1．2 培养基及抗生素的使用 常规的大肠杆菌培养基为LB和 I ；链霉菌液体培养用YEMEl2；固体产孢培养基 为2CM_]；链霉菌原生质体再生培养基为R5_2；大肠杆菌培养中使用氨苄青霉素的终浓 度为 l0og／m1；链霉菌培养时使用卡那霉素的终浓度为5g／ml；链霉菌基因表达时，诱 导用的硫链丝菌素的终浓度为5~g／ml。 1．3 DNA克隆操作 常规操作见文献[4]；链霉菌的遗传操作见文献 [2]；基因在链霉菌中的诱导表达及检 测见文献[1]；透明颤菌血红蛋白的活性分析方法见文献 [5]。 1．4 其它 为了从 pRK404vhb质粒上扩增和分离到具有合适限制酶位点的血红蛋白基因，设 计并合成了如下两个引物：OligoA5-CCCA_rATGTT