重组毕赤酵母生产外源蛋白的过程控制与代谢优化-猪α干扰素的高效表达.pdfVIP

全国生物化工技术发展研讨会论文与成果汇编 2011 济南 重组毕赤酵母生产外源蛋白的过程控制和代谢优化．猪Q干扰素 的高效表达 史仲平，江南大学生物工程学院，教育部工业微生物重点研究室 达生产pIFN．a的最优化发酵工艺进行了系统性研究。研究发现，1)使用基于人工神经 网络模式识别的控制系统(ANNPR-Ctrl)，可以实现重组毕赤酵母高密度培养的高效化、 自动化和通用化。在细胞生长期，采用ANNPR．Ctrl控制系统流加底物，可以将整个培 养期的底物浓度控制在一个较低的水平，在相同培养时间下表达猪Q．干扰素和植酸酶 的重组毕赤酵母细胞浓度分别比使用DO．Stat法控制时提高了81％和44％，有效地缩短 了培养周期。2)传统300C甲醇诱导条件下，甲醇浓度控制在10∥L左右的水平，02 是因为培养期的不适当甘油流加、导致重组毕赤酵母细胞骨架或功能不健全所致。利用 多状态变量在线测量和聚类分析的方法监控底物(甘油和02)比消耗速度与细胞比生 长速度之问的关系，可以在第一时间及时地发现故障或采取措施排除故障，为高效稳定 的毕赤酵母发酵生产plFN．a工艺的形成提供了条件，pIFN—Q抗病毒活性可稳定在 1．0×106 诱导温度到200C有利于改善发酵性能指标。与300C下的同类指标相比，醇氧化酶 从5．10h缩短到1h。另外，200C诱导条件下，发酵系统对外部干扰、特别是甲醇过量 添加的抵御能力大大提升，细胞可以耐受40∥L以上甲醇的冲击。发酵系统在200C下 的高甲醇抗冲击能力有利于降低过程对甲醇精密测量和控制的要求，强化发酵过程的操 的新工艺，使用该工艺条件可以解除因供氧不足所导致的能量运转的劣化，促使pIFN—a 7 IU／mL。6)在10L罐下，利 有效表达时间延长，pIFN一0L抗病毒活性最高可达3．62x10 用多变量在线检测和代谢分析的手段，研究了诱导温度对碳代谢流分配与能量再生效率 ／速度的影响和规律，并对中大型罐下的最优和可实现的操作模式进行了初探。结果显示， 降低诱导温度不但可以提高AOX活性和pIFN．a的表达水平，还可以造成胞内产能途径 和目标物质合成途径的代谢流分配比例的改变，可以强化走向pIFN．a合成途径的碳代 谢流通量。更加重要的是，200C诱导条件下，产能途径中所生成的NADH可以得到有 效的利用，提高了ATP再生效率，绝对ATP再生速度也增加近50％，使得毕赤酵母发 15 2011 全国生物化工技术发展研讨会论文与成果汇编 济南 酵生产外源蛋白的整体效率得到改善。7)对传统甲醇诱导和甲醇／山梨醇共混诱导下甲 醛异化途径和TCA循环途径中关键酶活性进行了比较分析。结果表明，甲醇／山梨醇共 混诱导使细胞能量供应途径发生了改变，甲醛异化产能途径明显被弱化，而TCA循环 产能途径则被强化，从而有效缓解了细胞的能量供应压力及甲醛异化产能途径中的毒副 产物甲醛对细胞的毒害作用。30oC诱导下，能量体系运转正常，10L发酵罐下的最高 IU／，mL，发酵成本明显下降，提高了整体发酵性能。 plFN．Q抗病毒活性达到1．8×107 代表性论文 Shi(责)， 1)MinjieGao，ShijuanDong,ZhenLi，RuisongYu，JianrongWu，ZhiyongZheng，Zhongping XiaobeiZhan： ofATP and in efficiencyoperationstability “Improvementregeneration porcine interferon一0L Pichia un