兔出血症病毒次结构蛋白(VP2)的生物学功能的研究.pdfVIP

第十三次学术研讨会会议论文集 兔出血症病毒次结构蛋白(VP2)的生物学功能研究 刘光清倪征2 陈柳2 (1中国农业科学院上海兽医研究所，上海200024l： 2浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，浙江杭州310021) 按要兔出血症病毒(RHDV)的基因纽仅编码两个结构蛋白，其中一种为衣壳蛋白( vP60)，另一种为次结构 蛋白(VP2)。目前，对衣壳蛋白的生物学功能已基本清楚。但是，关于次结构蛋白的生物学功能还不是很清楚。为此， 本研究利用反向遗传学技术结合体外表达技术，系统研究了该蛋白的生物学功能。研究结果表明，RHDv的基因组 缺失次结构蛋白(v1)2)后，病毒的侵染性有所降低，但是病毒基因组的复制能力和衣壳蛋白的表达水平有所提高， 说明VP2不是维持RHDV侵染性所必需的蛋白。体外研究也表明，vP2的缺失并不影响病毒样颗粒的组装，提示该 蛋白不是组成病毒衣壳的组成成分。通过对接种vP2的细胞进行DAPI染色和DNA片断分析研究，发现vP2具有 诱导宿主细胞凋亡的功能。由此，可以推测vP2可能在RHDv的致病机制过程发挥重要作用． 兔病毒性出血症病毒(Rabbit disease hemon．hagicvillls，RHDV)是一种对兔具有高度致病性和致 死性的病毒，对养兔业的健康发展具有严重威胁性。RHDV的基因组为一条单股正链的RNA分子，由 约7437个核苷酸组成。基【大J组含有2个开放阅读筐架(ORFs)：其中OIul编码一个大的多聚蛋白， 分子量约257l(Da，该蛋白可被进一步水解为罕少8个莺要蛋白。其中7个主要蛋白的排列顺序为： NH2．p1l—p28一 巴结构(poly(A)。 部分序列缺失或替换后对ORF2的表达没有明显影响。但是oRFl3’端的84个核苷酸对vP2的表达却很 关键。研究现象还显示VP2即使在没有起始密码存在的情况下也可以表达，甚至用外源基凶将0鼬2 的序列几乎全部替换也不影响其翻译。推测可能oRF2的翻译并不依赖于起始密码(AUG)的存在，而 要求起始位点上游的某序列元件必须存在。目前关于RHDvvP2的生物学功能还不清楚，国内外也 没有人开展过这方面的研究，为此本研究拟存前期研究的基础上，系统研究vP2的生物学功能，包 括该蛋白对RHDV的感染性、病毒复制以及其它结构蛋白表达的影响等方面。 1材料与方法 1．1材料 转染试剂Lipofectamine 有限公司，羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物公司。 1．2方法 1．2．1 pRHDV△VP2突变体的构建 Narl7361+： 5’．TACCACTGGCG CCTCCAGTGA．3’；Narl736l一：5’一TCACTGGAGGCGCCAGTGGTA．3’。然后， 接起来，即获得pRHDV△vP2突变体。 1．2．2转染RKl3细胞 DNA(5肛g)与转染试剂混合，然后将该复合物加至清洗过的细胞中，在含有5％C02的培养箱中，37℃ 孵育4h后，用含有10％胎牛血清的DMEM更换转染培养基，继续培养，观察细胞病变的出现情况， 待细胞出现80％左右病变时收获病毒。 其他动物病 1．2．3 同接免疫荧光检测病毒vP60表达 收取载有转染细胞的载玻片，用PBs缓冲液漂洗1～2次，冷丙酮20℃固定30rnjn，漂洗后吸干残 湿盒中，孵育30Inin，用甘油封片于olympus荧光显微镜F观察． 1．2．4病毒滴定 首先用病毒维持液10倍系列稀释病毒，然后将长成单层的RKl3细胞的培养液倒掉，接种系列 稀释的病毒液，每个稀释度至少4个孔，每孔25止，对照孔和感染病毒孔加入100止维持液，在含 有5％C02的培养箱中，于37℃孵育．每天观察并记录出现CPE的情况．当细胞病变不再发展时，用 风蜘一Muench公式计算病毒滴度． 1．2．5 荧光定量RT．PcR 用体外转录物转染RKl3细胞，培养48～72h后收集转染细胞的裂解上清，根据荧光定量 RT-PCR试