一种自剪切内含肽重组酿酒酵母表达优化研究.pdfVIP

第 15卷 第4期 2015年2月 科 学 技 术 与 工 程 V0l_15 No．4 Feb．2015 1671— 1815(2015)04—0011—06 ScienceTechnologyandEngineering ④ 2015 Sci．Tech．Engrg． 生物科学 一 种 自剪切内含肽重组酿酒酵母表达 优化研究 王晶晶 张 旭 刘建平 王洪海 (复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室，上海200433) 摘 要 自剪切内含肽纯化系统在大肠杆菌中已经得到很好的应用。为了在真核生物中应用该系统，以酿酒酵母为宿主， pHR质粒为表达载体，构建微型内含肽AI—CMintein酿酒酵母表达系统。以猪免疫球蛋白IgG的Fcdomain为亲和标签，绿色 荧光蛋 白g 为报告蛋 白，在酿酒酵母 GPD强启动子作用下，表达 出融合 的Fc—intein一 蛋 白。检测发现融合序列在起始密 码子ATG前加入一段Kozak序列有利于g；)『表达。在此基础上，将微型内含肽 AI—CMintein序列替换成密码子优化的AI．CM— intein—O序列，显著促进 g7})蛋 白的表达量，初步实现了AI—CMintein融合蛋 白的高效表达。为新型 自剪切 内含肽酿酒酵母表 达系统的建立和重组蛋白高效纯化的实现奠定了基础。 关键词 微型内含肽 自剪切 酿酒酵母表达系统 Kozak序列 密码子优化 中图法分类号 Q819； 文献标志码 A 蛋 白质高效表达与纯化是现代生物技术领域的 分为两种，一种是全功能型内含肽，它主要 由两个功 关键技术。通过亲和标签 (affinitytag)纯化 目标蛋 能域组成，分别是N端和C端的剪切区(splicingdo— 白是 目前实验室研究中广泛应用的一种技术。 目标 main)以及 中间的归巢核酸内切酶区域 (endonu— 蛋 白与亲和标签一起融合表达 ，所产生的融合蛋 白 c]easedomain)，这种 内含肽的分子量 比较大，应用 通过一步亲和柱层析就能够达到较高纯度，而且可 性不广 ；另外一种，称为微型 内含肽 ，即mini．intein， 以高通量地应用于不同 目标蛋 白的纯化，是一种颇 这种 内含肽 比较小，缺失了中间的归巢核酸 内切酶 具潜力的平台技术。但很多 目标蛋 白纯化后需要应 片段，只保留了内含肽的N端和C端片段。如结核 用位点特异性蛋 白酶去除融合的标签，一方面蛋 白 分枝杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis，Mtu)RecA 酶价格昂贵，另一方面水解产生的亲和标签去除还 mini—intein，168个氨基酸 ，分子量为 18kDa 。D． 需额外的纯化步骤，极大地提高了生产成本，限制了 W．Wood等人对 RecAmini—intein进行了一系列突 亲和标签融合表达技术在医药工业领域的应用。一 变改造，最终获得一种具有温度和pH值依赖性的 种 自剪切 内含肽(self-cleavingintein)亲和标签技术 AI—CMintein，并且只在 C端剪切 。 在降低重组蛋 白纯化过程中亲和标签清除成本方面 内含肽可控性剪切的实现为其在基因工程领域 具有很好的应用潜力 ¨。。 的应用奠定了基础。 目标蛋 白与 内含肽．亲和标签 内含肽 (intein)是一种能够进行蛋 白剪切和再 融合表达后，通过亲和介质层析纯化融合蛋 白，改变 连接的特殊蛋 白，通常位于多肽序列中间，和它对应 溶液体系环境，诱导内含肽 自剪切，释放 目标蛋 白。 的概念就是位于内含肽两侧的外显肽 (extein) I4j。 不需蛋 白酶处理，只要一步柱层析就可 以快速便捷 内含肽最早在酵母 中发现，随后又在不同的生物 中 地获得高纯度 目标蛋