RNA表达研究经验总结.pdfVIP

基因表达研究系列之——RealTime PCR 试验操作指南 目 录 目录1 一、样品处理 2 1. 组织样品2 2. 细胞样品 2 二、总 RNA 的提取2 三、反转录获得第一链 cDNA 3 四、RealTime PCR （主要介绍SYBR Green 染料法） 4 1. 引物设计4 2. 反应体系配制和优化 5 3. PCR 反应程序设置和优化5 4. 结果分析、数据处理 6 1 硕士的时候穿着厚厚的防护服做 Northern Blot 、反反复复的优化 PCR 反应条件做半定 量 RT-PCR ，一个试验做下来顺利的话也得数周，闹不好就得花上几个月。现在 RealTime PCR 仪的实时监控性能，使得 RNA 的表达定量变得简单多了，一个上午就能获得实验数据，而 且试验的重复性也大幅提升。在注意一些试验细节的情况下，总的来说 RNA 的表达检测还 是很容易的。这里把自己的一些操作心得总结一下，希望对大家有所帮助。 一、样品处理 1. 组织样品 所有的器皿（剪刀、镊子、研钵）最好 0.1% DEPC 水浸泡 24h （不用DEPC 处理问题 也不大，但要高压灭菌），一次性 EP 管、枪头不用处理，可直接使用。组织样品要分装到 多个 EP 管中，每管 0.5g 就可以了（可提取 3～4 次），每次取一管，避免样品反复冻融。每 次取 0.1~0.2g 进行研磨。样品最好还是用液氮下研磨，也可用电动组织研磨器（做好防护）。 2. 细胞样品 细胞样品做 RealTime PCR 的时候通常 6 孔板一个孔就足够了，24 孔板一孔通常也没有 多大问题。通常细胞可在培养板中裂解，直接提取总 RNA 。用胰酶消化下来以后再加入 Trizol 也可以。 二、总 RNA 的提取 总 RNA 的提取相对microRNA 的提取（单独介绍这部分）来说比较简单，使用TRIzol 试剂就可以了。TRIzol 试剂采用沉淀的方法获得总 RNA ，这比离心柱型方法获得的总RNA 量更多。个人做过试验比较，TRIzol 比离心柱能获得更高的检测灵敏度和重复度，当然离 心柱获得的总 RNA 纯度更好，不过对定量试验来说检测灵敏度和样本中 RNA 的真实度才 是最重要的。置于选择购买哪一厂家的可根据促销情况来定，Invitrogen 的TRIzol 试剂（货 号：15596-026）作为经典试剂质量一直稳定，价格也贵一些。国产的TRIzol 试剂用过一些 厂家的质量也不错（HaiGene ，货号：B0201 ；CWBIO，货号：CW0580A ），没有感觉到性 能上的差别。 材料：TRIzol 试剂（Invitrogen ，货号：15596-026；HaiGene ，货号：B0201 ；CWBIO，货 号：CW0580A ）、研钵、液氮、75 ％乙醇、异丙醇、氯仿、1×TE Buffer （RnaseFree ）（HaiGene ， 货号：S0105） 设备：离心机、Nano2000Drop 操作步骤： （1）组织样品（50mg 左右）使用研钵在液氮条件下研磨，研磨后直接加入到 1ml TRIzol 试剂中，立即上下混合均匀，使组织成弥散状，放 10min，13000rpm 离心 5min，将上清转 移到新的 EP 管中，加入 0.2ml 氯仿，上下混合均匀，室温放 10min。 细胞样品在培养板中 PBS 洗涤干净后，用枪头吸除干净所有的 PBS 溶液后，加入 1ml TRIzol 试剂用枪头吹打细胞，室温放 10min，后转入 1.5ml EP 管，直接加入 0.2ml 氯仿，上 2 下混合均匀，室温放 10min。 （2 ）13000rpm 离心 10min，将上清转入到新的EP 管中。加入 0.6ml 异丙醇，混合均匀，-20 度放置 10min，13000rpm 离心 15min，倒掉上清。用