犬细小病毒病PCR检测方法的建立及应用.pdfVIP

2013年第十五次全国养犬学术研讨会暨g-e次全国小动物医学学术研讨会论文集 犬细小病毒病PCR检测方法的建立及应用 陶明江1 张祥华1 孙明1 余恩超1 陆家卿1 陈如圣2邓刑2邬向东1 (1：江西农业大学动科院南昌330045；2：江西农业大学兽医院南昌330044) 摘要：犬细小病毒病感染是由犬细小病毒(CPV)引起犬只死亡的最重要传染病之 一，目前诊断该病的方法主要是胶体金快速检测试板，虽然检测方法较简便快速，但其 该病毒VP2基因保守序列设计引物，通过对阳性病料扩增及扩增产物测序，与NCBI发表 的相关基因对比，同源性在99．8％一100％，成功建立了特异性、灵敏度高的PCR方法， DNA模板。在对28例可疑CPV病例检测中，本方法检出25例阳性、3 最低只需2．5pg 例阴性，阳性率为89．28％；胶体金检测板检测出20例阳性、8例阴性，阳性率为 71．42％。证实PCR方法比胶体金检测更敏感。 关键词：犬细小病毒；PCR；检测方法 犬细小病毒(Canine MJ等在美国从患 吐、腹泻、出血性肠炎和化脓性心肌炎为主要特征的。1978年，Appel 肠炎的病犬中分离获得CPV…，之后在欧、美等一些商业饲犬场，相继有流行和造成幼 犬群损失的报道，除美国外，己相继在英国，德国和法国发现。在1983年，我国的徐汉 坤等首次正式报道了犬细小病毒病在我国的流行情况旧1。研究报道日趋增多，殷震 (2000)发现它在抗原性上与猫泛白细胞减少症病毒有密切关系∞j。自从分离到CPV以 来，在我国各地均有陆续报道该病在犬群中发生。 犬细小病主要引起成年犬发生出血性肠炎、幼犬发生心肌炎，临床伴有很高的发病 率及死亡率，是影响犬生存的最重要传染病之一MJ，通常以疫苗来控制CPV的流行，因 发病后主要以急性腹泻为主要症状，以对症疗法结合抗体特异性治疗是基本原则，早期 治疗有较好的转归效果，如晚期发现，则很难治愈。早期诊断治疗十分重要，因此对该 病的治疗成功的关键是早期快速诊断。目前兽医门诊广泛使用的胶体金检测板因其灵敏 列设计引物，通过对阳性病例试验，成功扩增到预期大小的特异基因片段，建立了CPV 的快速PCR诊断方法。通过扩增基因片段测序，验证该方法扩增结果可靠，并经应用于 临床检测，结果PCR检测率明显高于胶体金检测板。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1引物设计 析，选择该病毒的特异性结构蛋白VP2基因中的保守序列，设计引物分别为CPV一2一P1 364 犬细小病毒病PCR检测方法的建立及应用 和CPV一2一P2，预期扩增片段大小为574bp，引物由Invitrogen公司合成。 tcaacc agt aga一3’ CPV一2一P1：5’一tgatggagc ctcata CPV一2一P2：5’一tcagctgctgga一3’ gat 1．1．2主要试剂 Mix、Taq×2 CPV胶体金检测板、CDV胶体金检测板，韩国安捷公司产品；dNTP PCR Mix为北京全式金公司产品；饱和酚为上海生工产品；无水乙醇、异丙醇、醋酸钠等 均为国产分析纯产品。组织裂液，参照分子克隆实验指南自行配制∞1。 CPV阳性病料、CPV阴性CDV阳性病料，为江西农业大学预防兽医学教研组保存， 并通过胶体金检测板检测的犬粪便或血液样品；伪狂犬阳性病料、圆环病毒阳性病料， 为江西农业大学预防兽医学教研组保存，通过PCR技术鉴定阳性的病料。 I．1．3主要设备 PCR仪、高速台式冷冻离心机，为德国爱本德公司产品；恒温箱、电泳仪、紫外分 析系统，为国产施迅公司产品；培清JS一680d全自动凝胶成像分析仪为上海培清科技有 限公司产品。 1．2方法 1．2．1样品DNA模板提取 L的组织裂解