犬源伪狂犬病毒BJ-RD株的分离鉴定及gE基因分析.pdfVIP

猪的传染病 犬源伪狂犬病毒 BJ-RD 株的分离鉴定及 gE 基因分析 *  钟承，张乐天，王巨实，陆梓杰，刘蕾，杨万莲，孙艳争 ，吕艳丽 （中国农业大学动物医学院，北京，100193） 摘 要 本研究对一例具有剧烈搔痒症状，但无明确传播途径的病犬的组织进行伪狂犬病毒（PRV ）特异性PCR 检测， 从脑干、三叉神经、交感神经和颈段脊髓中扩增出预期大小的DNA 片段。将PCR 为阳性的脑干组织病料接种Vero 细 胞，培养72h 后细胞发生圆缩，脱落等病变。对出现稳定病变的细胞培养物进行PRV PCR 检测获得预期大小的DNA 片段，用PRV mAb 进行免疫组化染色，部分细胞中出现大量棕褐色阳性颗粒，从而判定感染细胞中存在PRV ，将此 分离株命名为BJ/RD 株。根据GenBank 登录的PRV （JF797219 ）序列设计引物，扩增gE 基因，并对扩增产物进行序 列测定与分析，结果显示，BJ/RD 株与此前分离的犬源毒株BJ/YT 及2012 年河北猪群分离株HB/HD 的gE 基因序列 完全相同（核酸同源性为100%），与2012 年河北地区分离株HB/HS 、HB/BD 、HB/LF 核苷酸同源性99.9%，与而与 国内外其他猪源PRV 分离株gE 基因序列有一定差异（BJ/RD 株gE 基因GenBank Accession No. KF017275）。 关键词 犬；伪狂犬病毒；分离鉴定；gE 基因；序列分析 犬伪狂犬病是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus ，PRV ）感染引起的以发热、奇痒和脑脊髓炎为 主要特征的烈性传染病[1] 。PRV 属于疱疹病毒科（Herpesviridae ）、α 疱疹病毒亚科成员，多种动物都 可以感染，其中猪最易感。病猪、带毒猪以及带毒鼠类为本病的重要传染源[2] 。犬也可以感染该病， 潜伏期2-9 天[3] [4] ，多在出现临床症状后4 天内死亡 ，致死率几乎100%。在成熟PRV 病毒粒子携带 的50 多种蛋白中，已经发现11 种糖蛋白[5] ，gE 是其中一种重要的糖蛋白。gE 蛋白虽然不是病毒复 制所必须的，但它对PRV 病毒体内毒力表达、侵袭神经和沿神经传递起着决定性作用[6] 。另外，gE 蛋 白也是PRV 重要的保护性抗原之一，可以刺激动物体产生保护性抗体。gE 基因的缺失可显著降低病 毒的毒力[7] 。 近年来中国农业大学动物医院先后接诊了多起疑似伪狂犬病毒感染的病犬，这些病犬大多数具有 直接或简介接触生猪肉及其相关产品的病史，通过流行病学、临床症状、病理变化和病原学检查等进 行了确诊。本文涉及的病犬，虽然具有典型的伪狂犬病临床症状，但无明确的传染源和传播途径，病 理剖检显示，该犬全身多系统脏器出现出血，淤血，坏死等病变，包括：胸腺表面大量有大量出血斑； 左心室心肌斑状出血，二尖瓣膜基部的心肌点状出血；脾脏边缘出现有多处绿豆大暗红色病灶；十二 指肠、空肠见严重弥漫性出血，肠管变薄；空肠淋巴结严重出血，水肿。这些病理变化与先前确诊P RV 病犬的病理变化极为一致。为此，本研究对该患犬进行了病原学检测，从中分离出了一株PRV 。 本研究结果为临床诊断犬伪狂犬病提供了重要的科学依据。 1 材料与方法 1.1 病料来源 病料来源于到中国农业大学就诊的有剧烈搔痒症状的伪狂犬病疑似犬，实施安乐死术后立即剖检， 观察大体病变，采集病犬的大脑，嗅球，小脑，脑干，颈段脊髓，三叉神经上颌支，迷走交感神经干， 心脏窦房结，肾上腺等组织。分别将组织病料与PBS 按V/V 1:10 制成悬液，用高通量组织研磨器破 碎成组织匀浆，之后迅速放于-80℃冷冻保存备用。 1.2 主要试剂、细胞和 PRV mAb 2×Taq PCR Master Mix 试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；pMD18-T 载体购自TaKaR a 公司；DNA 回收试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；胎牛血清（FBS ）、DMEM 培养基购自H yclone 公司；鼠抗PRV mAb 由中国农业大学动物医学院何伟勇副教授惠赠；封闭用羊血清、PV-900 2 小鼠超敏二步法免疫组化检测试剂盒、DAB 显色剂均购自北京中杉金