人肝星状细胞COL1A1与TGFB启动子克隆及活性分析.pdfVIP

  人肝星状细胞 COL1A1 与 TGFB 启动子克隆及活性分析 赵双双 何红伟 邵荣光 （中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所，北京 100050 ） 摘要：目的 探索肝纤维化关键基因 COL1A1、TGFB 的转录水平调控机理，为进一步的机理研 究打下基础。方法 提取肝星状细胞基因组 DNA ，设计引物进行PCR 将 COL1A1 与 TGFB 启动子序 列调取出来，通过 DNA 重组技术将目的片断定向克隆至 Luciferase 报告载体 pGL4.17 中，经酶切、 序列测定鉴定重组质粒。经细胞转染，采用双荧光素酶报告基因测试技术，检测 TGF-β1 对 COL1A1P 与 TGFBP 的活性影响。结果 成功构建质粒 pGL4.17- COL1A1P 和 pGL4.17-TGFBP ；TGF-　1 使萤 火虫荧光素酶的荧光明显增强。结论 构建了用于研究 COL1A1 和 TGFB 基因的启动子调控机理的 双荧光素酶报告系统，可以用于进一步的机理研究。 关键词：肝纤维化；转化生长因子　1；肝星状细胞；双荧光素酶报告基因 肝纤维化（liver fibrosis ）是肝脏对慢性损伤的一种修复反应，其特征表现为细胞外基质(特别是 胶原) 的过度沉积。肝纤维化的进一步发展会导致肝硬化，并最终需要肝移植来延续生命。肝星状细 胞（Hepatic stellate Cell ，HSC ）的活化是肝纤维化的细胞学基础。当肝脏受到各种原因的刺激造成 损伤时，肝星状细胞就会被激活，细胞形态发生改变并大量增殖，并分泌大量的细胞转化生长因子 　 （Transforming growth factor beta，TGF-　），TGF-　会刺激肝星状细胞更进一步的激活。同时肝 星状细胞会大量表达　平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)，合成细胞外基质尤其是Ⅰ和 Ⅲ型胶原（Collagen ），特异性降解肝组织正常细胞外基质（主要是 IV 型胶原）的基质金属蛋白酶 MMP2/9/13 等以及其它肝纤维化相关蛋白。肝星状细胞增殖抑制和凋亡增加会促使炎症反应减轻和 纤维化消退，是抗肝纤维化、肝硬化治疗研究的重要的靶细胞。 研究表明，TGF-　可以通过 TGF-　/Smad 通路促使 TGFB、COL1A1 等关键肝纤维化相关基因 的转录激活，其中 TGF-β1 是目前公认的最重要的致肝纤维化的细胞因子之一。我们的前期研究发 现维甲酸可以在人的肝星状细胞中抑制这种激活，但具体的调控机理还不清楚。为了进一步研究肝 纤维化相关基因转录调控的机理，本研究通过克隆 COL1A1 与 TGFB 启动子，分别构建成双荧光素 酶报告系统，检测外源性 COL1A1 与 TGFB 启动子在人肝星状细胞中是否具有活性，能否被 TGF-　 更进一步的激活，为进一步研究肝纤维化相关基因的转录调控机理，维甲酸及其它药物对 COL1A1 与 TGFB 启动子活性影响打下基础。 1 实验材料 1.1 主要试剂与试剂盒 ® Premix PremixSTAR HS （TaKaRa ），胰蛋白胨tryptone （OXOID ），Biowest 琼脂糖（上海基因 科技有限公司），DNA 限制性内切酶（TaKaRa ），T4 DNA 连接酶（TaKaRa ），Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent （Invitrogen ），OPTI-MEM® I Reduced Serum MediumReduced Serum Medium （Invitrogen ），DMEM 培养基（GIBCOBRL product, Grand Island, N.Y. USA ），细胞转化生长因子　1 (240-B) 2ng/ml （RD Systems, Minneapolis ），血液/组织/细胞基因组 DNA 提取试剂盒（天根生化 科技有限公司），普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（天根生化科技有限公司），普通质粒小提试剂盒 （天根生化科技有限公司），Dual-Luciferase® Reporter Assay System （E2610, Promega ）。