巴斯德毕赤酵母基因组外源基因整合数的高通量定量分析.pdfVIP

第28卷第 7期 第 三 军 医 大 学 学 报 Vol·28，No·7 640 2006年 4月 ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE Apr·2006 文章编号：1000-5404(2006)07—0640—40 巴斯德毕赤酵母基因组外源基因整合数的高通量定量分析 吴丽娟 ，蒋建新 ，朱佩芳 ，康格非 (第三军医大学大坪医院野战外科研究所第四研究室，全军交通医学研究所，全军 交通医学实验室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 40(K~2；重庆医科大学医学检验系，重庆4OOO46) 提 要：目的 探索一种巴斯德毕赤酵母表达体系外源基因整合数的高通量定量分析方法。方法 采用基因工程 技术构建pPIC9K．HG质粒作为定量标准品，建立毕赤酵母基因组外源基因整合的高通量定量PCR分析方法，用灵敏度、 特异性等对方法进行评价，将之初步用于hA20基因毕赤酵母转化子外源基因整合数的分析。同时对 3种酵母基因组制 备方法进行了比较。结果 方法灵敏度达 10。拷贝，线性范围在 10 一10，平均变异系数6．62％，特异性 100％。14株 hA20基因毕赤酵母转化子外源基因整合数分析显示，成功收获外源基因整合数为单拷贝、3拷贝、10拷贝、13拷贝、17拷 贝、50拷贝的阳性转化子。酵母基因组制备经典法、煮沸法和酶法阳性率分别为85．71％、28．57％和85．71％，经 检验 证实，酶法与经典法相比提取酵母基因组的效率一致 (P0．05)；煮沸法与经典法相比提取酵母基因组的效率存在显著性 差异(P0．05)。结论 成功建立了巴斯德毕赤酵母基因组外源基因整合数高通量定量分析方法 ，方法学评价指标满意， 可广泛用于不同外源基因整合之阳性菌株的大批量分析。酶法制备酵母基因组具有可靠、简单、迅速等优点，适合大规模 提取酵母基因组。 关键词：基因表达；异种基因；多聚酶链反应；基因整合 中图法分类号：R394-33；R394．3 文献标识码 ：A Higll-throughputquantitativeanalysisforintegrationnumberofexogenousgenein Pichiapastor~ genome WULi-juan，JIANGJian—xin，ZHUPei—fang，KANGGe—fei(StateKeyLaboratoryofTrauma，BumsandCombinedInjury， Department4，InstituteofSurgery Research，DapingHospital，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400042，FacultyofLaboratory Medicine，ChongqingUniversityofMedicalSciences，Chongqing40O046，China) Abstract：0bjective Hereweestablishahigh—troughputquantitativemethodforidentifyingtheintegra— tionnumberofexogenousgeneinPichiapastorisgenome．Methods pPIC9K—HG wasconstructedbygenetic engineering．Aftersequencing，pPIC9K—HG wastaken asthe standard ofrqunatitativeanalysis．A high— throughputmethodwassetupofrdetectingtheintegrationnumberofexogenousgeneinPichiapastorisgenome na devaluatedwith methodologicalindexessuch assensitivity，specificity。etc．Copiesofh