口蹄疫病毒Asia1型感染BHK-21细胞的定量蛋白组学分析及验证.pdfVIP

中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会论文集 口蹄疫病毒Asial型感染BHK一21细胞的 定量蛋白组学分析及验证 郭慧琛，靳 野，韩世充，魏衍全，王海明，董 虎，刘湘涛，孙世琪’ (中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室／El蹄疫OIE参考实验室，甘肃兰州730046) 摘要：口蹄疫病毒感染宿主细胞将引起细胞多个基因表达水平的改变。为了揭示1：7蹄疫病毒的致病机制及 141个蛋白，其中 物信息学分析．检测了口蹄疫病毒亚洲I型感染BHK．21细胞后的蛋白表达情况，结果确定了2 153个蛋白在病毒感染8小时之后其表达水平有显著改变(57个蛋白表达水平上调，96个蛋白表达水平下调)。应 功能等方面，并涉及14个调控网络(network)。为了进一步验证这些表达水平有差异的蛋白可能与病毒的复制有 关系。分别选择六个蛋白的干扰性RNA，并将其转染细胞后确定了各个蛋白对FMDV滴度的影响。这些结果显 示，FMDV感染后，细胞中蛋白表达水平的改变是细胞与病毒问相互作用的适应性调节。本研究也进一步证实了 定量蛋白组学SILAC方法结合LC—MS／MS，在病毒与宿主相互作用研究中的可行性及优势。 关键词：口蹄疫病毒；定量蛋白组学；致病机制；SILAC 疫苗，故选用该细胞来进行研究。本研究表明，与 口蹄疫(FMD)是偶蹄动物的一种急性、高度接 触性传染病，该病不仅严重影响畜牧业生产，而且 正常细胞相比，感染FMDV的BHK．21细胞发生了 大大限制动物及其产品的出口贸易，从而造成巨大 较显著的蛋白质组学变化，并进一步证明了SILAC 经济损失。 定量蛋白质学分析对鉴定病毒复制中的重要宿主因 FMDV感染细胞是一个精细复杂的过程，在其素以及探究宿主．病原的相互作用是可行的。 整个生命周期中，FMDV和细胞之间的作用方式多 种多样，其中涉及到细胞对FMDV的抵抗及FMDV 1材料和方法 劫持细胞来进行有效增殖。然而，FMDV的致病机 理仍不清楚。因此，宿主细胞和FMDV相互作用的1．1 深层次研究，对理解FMDV感染过程变得尤为重 要，这还可能有助于有效抗病毒药物和潜在疫苗的 【U一13C6]．L．Lysine 开发。为此，利用细胞培养条件下稳定同位素标记 L．1ysine外，不含其他氨基酸)中传代培养，确保 技术(SmAC)，并结合高效液相色谱，串联质谱法 (LC．MS／MS)来探究感染FMDV细胞的蛋白质组学 变化。鉴于BHK-21细胞广泛用于生产FMDV灭活 author *Corresponding 作者简介：郭慧琛(1974．)，女，宁夏人，副研究员．博士，主要从事动物病毒分子生物学研究 +通信作者：E-mail：shiqisun21@hotmail．com 一254— 中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会论文集 h后收集 L-Lysine一2HCI(L)标记细胞不接毒，感染6 l h后，用4％PFA固 细胞。 h后，清洗、换液，再感染5 1．2 梯度凝胶电泳、蛋白胶内消化及LC—MS／MS 分析用5％SDS—PAGE加样缓冲液收集细胞，煮 沸10min，进行梯度凝胶电泳(4％～12％)，考马 斯亮蓝染色。整个蛋白胶分为48份，用胰酶(20 ng／ixL)；消化，随后用2．5％甲酸和90％乙腈除去胰 酶，冻干处理后，再用0．1％甲酸和2％乙腈重悬样 400)标记；用DAPI标记细胞核。然后用激光共聚 品。然后将样品送往广州辉骏生物科技有限公司进 焦显微镜观察。 行LC．MS／MS分析 1．3 蛋白质定量及生物信息学分析