16-2-高效液相色谱法.pptVIP

* * 高效液相色谱法 (HPLC) 一、 概述 ?高效液相色谱法与经典液相色谱法 经典液相柱色谱装置 高效液相色谱仪 3-10 μm 高压泵 快(1-10mL/min) 150-200 μm 重力或低压泵 很慢 固定相粒径 流动相驱动方式 流动相流速 HPLC 经典液相色谱 例：分离20种氨基酸 柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: 20 h 经典柱色谱 HPLC t分离：1 h 二、 基本理论 1、色谱柱柱效的基本关系式 2、分离度 3、 速率方程 溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气相中扩散系数的万分之一 流动相流速对板高的影响 小颗粒填料，填充均匀； 选择较低的流动相流速； 选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。 修正的速率方程： 提高柱效途径 三、 高效液相色谱分离方法 1、吸附色谱法 分离原理 Kad值越大，保留时间越长。 固定相 硅胶－强极性 氧化铝－弱极性 活性炭－非极性 分子筛－强极性 高分子多孔微球(GDX) 固体吸附剂 3、 离子交换色谱法 阳离子交换树脂 阳离子交换 阴离子交换 分离原理 固定相 阳离子： －SO3H(强) －CO2H(弱) 阴离子： －N+R3(强) －NH2 (弱) 基质 合成树脂 纤维素 硅胶 离子交换剂 流动相 水相缓冲液+有机改性剂 调节选择性的主要参数 盐种类及浓度 pH值 各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序： 用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快 应用： 离子及可离解的化合物 如氨基酸、核酸、蛋白质等 4、 化学键合相色谱 采用化学键合相的液相色谱 固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。 特点 键合固定相制备 ODS(C18)键合相 硅胶 十八烷基氯硅烷 非极性 硅烷化反应 使用pH范围： 2-8 键合固定相类型 疏水基团 烷烃（C8和C18）、苯基等 极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等 离子交换基团 胺基、季铵盐 磺酸、羧酸 键合相色谱法分类 ?反相键合相色谱: 常用固定相：C18 分离对象 非极性 中等极性化合物 常用流动相 甲醇-水 乙睛-水 反相键合相色谱 疏溶剂分离机制 固定相极性流动相极性 ?正相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 ?离子性键合相色谱 将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。其分离原理与离子交换色谱类同。 例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水 出峰顺序：苯酚，甲苯 出峰顺序：甲苯，苯酚 十八烷基键合相 二醇基键合相 保留时间： 例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。 没食子酸 3,4-二羟基苯甲酸 固定相: 非极性; 流动相: 极性 组分极性: 3,4-二羟基苯甲酸没食子酸 5、 尺寸排阻(凝胶)色谱法 排阻色谱分离示意图 相对分子质量差别 大于10％的化合物 才可以分离 分离原理 四、 高效液相色谱仪 高压泵 流动相溶剂 废液 色谱柱 进样口 检测器 1、 高压输液系统 高压泵 要求 输出压力高 平稳、脉冲小 流量稳定可调 耐腐蚀 梯度洗脱装置 低压梯度 高压梯度 通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子α值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。 梯度洗脱 等度洗脱与梯度洗脱 *