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使用 imagepro-plus测量荧光强度 如今,使用荧光染料进行免疫组化染色的实验非常普遍,荧光染料染色细胞的荧光强度也能反映细胞 中相关蛋白的表达强度,自然而然的,大家会想到是否可以通过IPP分析细胞或组织切片的荧光照片 来分析其荧光强度,并以此来表示相应蛋白的表达强度。 非常令人沮丧的是,这个想法是很难实现的。这个网页详细说明了理由。 /answers/showquestion.asp?faq=36fldAuto=325 里面的结论是:You DONT! Image Pro Plus can provide Intensity or Density measurements for any image. However, unless the image acquisitions system is properly calibrated, those numbers may not have any useful relationship with the real world. IPP的分析结果与实际情况是有很大误差的,这个误差不是IPP的错,而是在制作样品及拍摄照片的 过程中引入的。 所以在介绍使用IPP分析荧光照片的方法之前,首先得说说如何拍摄荧光显微镜照片。这可能比IPP 的操作还要重要。 荧光显微镜拍摄的样品,是使用荧光染料染色的,使用荧光显微镜时最重要的,是选择合适的激发光 滤光片与荧光滤光片。正确选用滤光片能得到足够强的荧光,但一般情况下,显微镜不可能配齐所有 的滤光片,更何况现在的显微镜滤光片价格都很贵,只能求其次,使用波段相近的滤光片,荧光强度 稍低一些。 粗略的选择是: 红色荧光染料,使用红色截止滤光片与绿色激发滤光片。 绿色荧光染料,使用绿色截止滤光片与蓝色激发滤光片。 蓝色荧光染料,使用蓝色截止滤光片与紫激发滤光片。 更精细的滤光片选择,可以参照下表: /jcyxy/zxlab/document/FluoDATA.xls 在拍摄荧光照片时,如果要分析荧光强度,与免疫组化照片一样,要确保每张照片的拍摄条件完全一 致。先拿一张荧光最强的样品观察调整显微镜。确定相机拍摄的曝光时间。荧光照片的曝光要注意的 事项有: 1.使荧光最强的部位不能曝光过度。判断标准是照出的照片在最亮处不能变色。比如绿色荧光照片, 当曝光过度时,亮处会变成黄色甚至白色,这就是曝光过度了。过度的曝光会导致测量数值变低。当 确定了一个曝光时间后,就必须以这个曝光时间拍摄所有的样品,绝不能使用自动曝光。 2.没有样品的空白部位应是纯黑色。这一点不一定能作到。特别是组织切片,由于样品的散射作用, 没有荧光的部位也会显示出一点荧光的颜色的。 3.荧光样品是有荧光淬灭效应的,当把样品放到载物台上后,要以最快的速度选择视野立即拍照。时 间越长荧光越弱,其衰减速度与时间的指数相关。这就是导致荧光强度分析误差巨大的最主要原因。 4.使用激光共聚焦显微镜拍摄荧光照片比普通荧光显微镜效果更好,能够更有效地控制所有照片的拍 摄条件保持一致。在条件可能时,尽量使用激光共聚焦显微镜来拍摄。 5.在拍摄细胞爬片上的细胞时,将爬片的细胞层向上,放置在载玻片上,然后再盖上一片干净的盖玻 片。很多人喜欢把爬片翻过来放在载玻片上,直接在镜下观察,这样并不好。爬片背面沾的培养液不 易擦净,导致图象不清晰。 6.许多情况下,在拍摄一张荧光照片后,还需在同一视野下拍摄一张细胞轮廓的普通光照片。由于没 有进行正常染色,这不容易照清楚。有个绝招管用:将显微镜的普通光聚光镜往下降得很低,就能照 出较清晰的细胞轮廓照片。 7.由于荧光实际上就是单色光,所以最好使用单色冷 CCD 作为拍摄相机拍摄 12 位或 16 位的灰度图 片。不过一般的显微镜现在基本都是使用彩色CCD的。在设备可能的条件下,要拍摄12位或16位的 图像。比如 Olympus 的 DP70 相机就可以拍摄这样的图片,图片文件会大一点,但对荧光照片的分析 是大有好处的。 拍摄完图片之后,在分析之前,还需对图片进行一下转换处理。 荧光图片上,表达最强所对应的是图片上的亮处,背景则是黑色的。这与免疫组化图片正好相反。所 以要先把荧光图片作一个黑白反相处理。IPP当然是可以作这件事的。其他的图象软件也都能作。如 果使用IPP来Invert contrast,一定要记得Invert之后还要apply contrast一下,否则图片实际 上是并没有改变的,它只是显示成了

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