免疫荧光操作步骤(漂片,冰冻切片).pdfVIP

免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片） 免疫组化步骤： 1.将脑片放到，6 孔板（或12 孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min （如果是从切片保护液取出，则要用PBS 洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差 别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒； 2.吸去双氧水，PBS 洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要 碰到脑片； 3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑 片一张需50 微升一抗稀释液，小鼠脑片为30 微升；注意不要让液体流到边上； 如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体； 4.然后，4℃，过夜（18h 或者24h ），不建议使用37 ℃； 5.然后，PBS 洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。 6.DAB 配方为：10mg DAB 固体加到20ml 0.01MPBS，临用时加100-200 微升 30%双氧水，注意避光。 7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。一般3 分钟显色就比较 明显，如果20 分钟仍未显色，则看下面的参考。 8.然后PBS 洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h 。 9.脱水：70%酒精3min ，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min， 二甲苯 2min，二甲苯 3-5min 。如果片子上盐分较多，在 70%酒精前在双蒸水 1min。 免疫荧光步骤及注意事项： 1，将脑片放到6 空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min ；（如果是从切片保 护液取出，则要用PBS 洗一遍） 2，吸去山羊血清，PBS 洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意 不要碰到脑片； 3，然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS 稀释后的一抗，一般， 大鼠脑片一张需50 微升一抗稀释液，小鼠脑片为30 微升；注意不要让液体 流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体； 4，4℃，过夜（18h 或者24h ），不建议使用37 ℃，如果荧光亮度不强，可以延 长孵育时间到48 或72 小时； 5，然后，PBS 洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2 小时。注意避光操作。 6，0.01M PBS 洗两遍，转移到载玻片上，避光自然晾干； 7，滴加防淬灭剂后，盖上盖玻片镜下观察。 常见问题： 1，荧光太暗：可能蛋白表达少；可能一抗孵育时间短；二抗孵育时间短；清洗 次数过多；溶液pH 不合适；荧光萃灭；一抗浓度过低或过高；二抗浓度过 低或过高；激发波长不在抗体适用波段。 2，背景荧光太深：一抗浓度过高，清洗不彻底；二抗浓度过高，清洗不彻底； 封闭时间过短，非特异性过强；一抗非特异性过强；二抗非特异性过强；显 微镜荧光强度过强。 总之实验是喜欢强阳性，不喜欢假阴性，呵呵。任何实验都需要花时间摸索才 能找到其最佳的工作条件。 熟能生巧，边学习边练习边思考方能学好。有不足之处，敬请各位老师同学批评 指正，以使该实验更加臻美。若有不解之处，请询冯展或者免 疫学技术交流群。QQ:929108912 谢谢。 祝实验顺利！ 另附免疫组化常见问题解析。原理是相同的，只是最后的显色方法不一样，有 些问题有启发作用。 免疫组织化学 1. 边缘效应? 原因: 1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将 组织下面试 剂洗尽所致. 解决办法：制备优质的胶片（APES 或多聚赖氨酸）， 切出尽量薄的组织切片，不厚于4 微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较 多的组织。 2 ）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较 中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用 组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。 2. 产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？ 1. 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。 解决办法: 这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。 2. 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。 3. 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞