分子植物病理学实验.docVIP

实验一 植物基因组总DNA的分离 分离植物核酸对大多数基因组分析以及利用遗传标记进行的作图研究而言，都是一个基本要求。同样，在鉴定和分离植物基因用于基因工程时也不例外。不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。例如，在构建用于筛选植物基因或其他诸如RFLP这样的遗传标记基因组DNA文库时，需要使用高相对分子质量、高纯度的DNA；而在进行遗传分析时，对DNA纯度的要求就可以低一些，但其他要求如DNA的产量则显得更为重要了。 一般而言，一个好的DNA分离程序应符合以下几个主要标准： ·所得DNA的纯度应满足下游操作的要求：用于RFLP分析的DNA，其纯度的要求为可用限制性内切酶完全酶解并可成功地转移到膜上进行Southern杂交；用于PCR分析的DNA则应不含干扰PCR反应的污染物。 ·所得DNA应当完整，电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型。 · 所得的DNA应有足够的量。例如，要研究多个遗传标记在某一植物居群中的分离情况，也许就要求从单株植物中提取的DNA可作100次分析；而在从大量植株中筛选一个单一遗传标记时，只需在一个Eppendorf 管中微量提取得到的DNA就绰绰有余了。 如果是对植物进行大规模筛选，还应当满足下面这项要求： ·操作程序应当快速、简便、价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂。 提取程序的原理 植物DNA的提取程序应包括以下几项： 首先，必须破碎（或消化）细胞壁释放出细胞内容物。然而许多操作在破壁的同时也会剪切DNA，因此任何方法都是在DNA的完整性和产量这两个方面之间折衷考虑的结果。分离总基因组DNA常用的破壁方法是将植物组织胀水，然后研磨成细粉；或者将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉。分离核DNA或细胞器DNA时则应采取更为温和的破壁方法，以免过早破坏内膜系统，人们通常采用在含有渗透剂的缓冲液中4℃匀浆的方法来破壁。 其次，必须破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中。这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB一类的去污剂来完成。去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。通常提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子—镁离子。 最后，一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。剧烈振荡或小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的DNA。一般说来，如果操作得当，可以得到相对分子质量长度为50～100 kb的DNA。 不过，分离高相对分子质量的DNA还只是工作的一部分。因为在DNA粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖、丹宁和色素等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过经处理过的RNaseA 除去。但多糖类杂质一般较难去除，这些杂质浓度高时，常常使DNA提取物呈胶状，更为重要的是即使是低浓度情况下它们也会干扰后续操作，如抑制某些DNA修饰酶包括限制性内切酶的活性，从而阻碍Southern杂交或基因克隆；同时多糖杂质还会影响分光光度法对核酸的定量分析等。 CTAB法分离植物总基因组DNA 本方法由Murray和Thompson（1980）及Saghai-Maroof等人（1984）的方法修改而成，相对较为简单，并已成功地从一系列的单子叶和双子叶植物中提取出总DNA。无论是新鲜材料或经脱水处理的材料，本方法均适用。虽然得到的DNA纯度并不很高，但仍能满足限制性内切酶分析或PCR扩增的要求。产率一般为100~200μg/g鲜重组织。 药品试剂 —─液氮 —─1×CTAB缓冲液:50 mmol/L Tris-HCl pH8, 0.7mol/L NaCl,10 mmol/L EDTA pH8, 1% CTAB,20 mmol/L 2-巯基乙醇(用前加入) —─氯仿/异戊醇(24:1) —─Rnase A:2000U/ml,用0.15 mol/L NaCl,0.015 mol/L柠檬酸三钠配成10 mg/mL;使用前100℃热处理15min除去残留的Dnase活性 —─异丙醇 —─76% 乙醇,0.2 mol/L乙酸钠 —─70% 乙醇 —─TE缓冲液: 10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA pH8 仪器设备 —─天平 —─研钵和杵子 —─50ml聚丙烯离心管 —─37℃、65℃、90℃水浴 —─宽口巴斯得吸管 —─离心机(转速至少可达5000g) —─4℃冰箱 操作程序 1. 向装有700～800mg磨碎的干燥植物组织［最好是经去淀粉处理］的50ml聚丙烯离心管中加入20 mL 65℃预热的1×CTAB提取缓冲液。轻轻转动离心管使植物组织在提取缓冲液中均匀分散，65℃温浴90min, 并不时轻轻转动离心管。 或者，将10g经去淀粉处理的新鲜植物材料用液氮速