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双荧光素酶及其注意事项 李鹏飞 2010年2月22 日 主要内容 1、载体选择 2、载体比例 3、细胞与培养 4 、工作液配制 5、细胞裂解与检测 6、结果分析 北京原平皓生物 1、载体选择 萤火虫荧光素酶载体： 海肾荧光素酶载体： • pGL3‐Control • pRL‐SV40 • pGL3‐Basic • pRL‐TK              减少“cross talk ” • pGL3‐Promoter • PRL‐CMV • pGL3‐Enhancer • pRL‐null • pGL4‐系列载体 • pGL4‐系列载体 北京原平皓生物 2、载体比例 • 一般海肾荧光素酶作为对照的报告基因 • 对照的报告基因表达不宜过高 • 建议通过预实验确定载体比例： – 将Fluc载体与Rluc载体稀释 – 按1:1、10:1、20:1、50:1、100:1分别混合 – 转染细胞，检测表达结果 • 载体比例以Fluc检测值稍大于Rluc为佳 北京原平皓生物 3、细胞与培养 • 同一荧光素酶载体在不同细胞中表达效果差异很大 • 常见的表达较高的细胞有293细胞、HeLa细胞 • 建议做3复孔或更多复孔 • 建议做空细胞对照和阳性对照 （使用pGL3‐Control等） • 根据实际情况选择细胞裂解时间 • 细胞培养时间不宜过长，长时间培养后细胞不易裂解 北京原平皓生物 4 、工作液配制 • 被动裂解液（PLB） – 建议现用现配，1 ×PLB在4 ℃存储不超过一月 • 萤火虫荧光素酶检测试剂（LAR II） – 底物与缓冲液一次混合、分装，避免反复冻融 – LAR II 在‐20 ℃稳定一月，‐70 ℃稳定一年 – 冰冻的LAR II溶解时，不要使用高温处理 • StopGlo试剂 – 建议现用现配 – 1 ×StopGlo 在‐20 ℃存储不要超过15天 – 冰冻的试剂溶解时，不要高温处理 北京原平皓生物 5、细胞裂