双靶区反义锁核酸对乙型肝炎病毒转基因鼠抗病毒疗效研究1.pdfVIP

双靶区反义锁核酸对乙型肝炎病毒转基因鼠抗病毒 疗效研究1 邓益斌，王燕菲 广州医学院生物化学与分子生物学教研室，广州（510182 ） E-mail: yanfeiw@ 摘 要：目的：探讨针对乙型肝炎病毒（HBV ）S、C 双靶区反义 LNA 对乙型肝炎转基因 小鼠HBV 复制和表达的影响。方法：设计合成互补于HBV S 、C 基因翻译起始区的反义LNA ， 与脂质体混合，经尾静脉注入小鼠体内，时间分辨免疫荧光分析法定量检测血清 HBsAg； 荧光聚合酶链反应（PCR ）定量检测血清HBV DNA 含量；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR ） 检测肝组织HBVC-mRNA 的表达；免疫组化法检测肝细胞HBsAg 、HBcAg 的表达；自动生 化分析仪检测血清清蛋白（Alb ）、谷丙转氨酶（ALT ）、尿素氮（BUN ）、肌酐（CR ）等指 标；小鼠肝脏、肾脏做常规病理切片HE 染色，观察反义LNA 对小鼠脏器的影响。结果： 血清HBsAg 的表达，注射后第 1d、3d、5d ，单靶区S 组的抑制率分别为23.3% 、37.9%和 48.7% ；单靶区C 组分别为21.2% 、32.6%和40.7%；双靶区SC 组分别为30.6%、61.2%和 72.8%。血清HBV DNA ，注射后第1 天开始下降，双靶区SC 组的DNA 下降最明显，其第 1d、3d、5d 下降率分别为18.5%、36.1%和52.9%。5 天后，单靶区S 组、单靶区C 组和双 靶区 SC 组小鼠肝细胞HBsAg 、HBcAg 的表达显著低于对照组。小鼠肝肾功能及组织学未 见异常。结论：HBV S 、C 双靶区反义LNA 对乙型肝炎病毒转基因鼠有显著抗HBV 作用， 且抑制作用优于单靶区反义LNA。 关键词：脂质体；锁核酸，反义；乙型肝炎；基因治疗；肝炎病毒，乙型；小鼠，转基因 中国图书分类号：R392 慢性乙型肝炎是乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus ，HBV ）感染引起的一种死亡率较高的 慢性传染性疾病，易发展为肝硬化、肝癌，是一个全球性的健康问题，全球约有 3.5 亿慢性 乙型肝炎患者，而我国的慢性乙肝患者约占 37.14% （约1.3 亿）[1] 。目前临床治疗药物主要 是干扰素和拉米夫定，干扰素疗效低，对母婴传播者更低，而拉米夫定对细胞内的 cDNA 无影响，不能彻底清除病毒。因此，探索对 HBV 感染者有效的抗病毒技术（药物）在我国 意义尤显重大。反义 DNA 技术，又称反基因技术，是近几年发现的基因治疗新技术，其抗 HBV 感染的机制是通过反义 DNA 与细胞内特定的双链 DNA 结合形成三链 DNA 分子，阻 止转录因子与特定 DNA 结合，从而在转录水平上阻断特定基因的表达，达到封闭乙型肝炎 病毒（HBV ）基因的目的，克服了反义 RNA 技术难以全部阻断 mRNA 的缺点。反义锁核 酸（locked nucleic acid,LNA ）技术是建立在反义DNA 技术基础上的更新的一种基因治疗技 术，具有更强的 DNA/RNA 分子杂交能力和抗核酸酶降解能力，国外主要用于抗人类免疫缺 陷病毒（HIV ）和丙型肝炎（HCV ）等RNA 病毒的研究，而用于抗乙型肝炎病毒（HBV ） 感染方面的研究尚未见报道。我们前阶段进行的体外研究表明，反义LNA 具有较强的抗HBV 基因复制和表达的能力[2] 。因此，我们设计合成互补于HBV S ，C 基因翻译起始区的双靶区 反义 LNA ，利用阳离子脂质体的组织靶向性，经尾静脉将反义LNA 导入肝细胞内，进一步 观察反义 LNA 在 HBV 转基因鼠体内的抗病毒效果。 1. 材料与方法 1.1 材料 1本课题得到广州市科委专项基金（2002E3-E4081）资助。 - 1 - HBV 转基因小鼠 30 只（体重 18~20g），雌雄各半，血清HBsAg(+) ，HBV DNA(+) ，购 自广州空军医院；LipofectamineTM2000 购自