核酸2 10秋.pptVIP

（四）真核细胞染色体DNA结构 五、RNA的结构 七、核酸的性质和最常用的研究方法 （四）RNA的三级结构 tRNA的三级结构 -----倒L型 X光晶体衍射解出的 tRNA 立体结构 （一）一般性质： 分子大小：DNA Mr 106～109或更大 性状： DNA为白色纤维状固体，而RNA为白色粉末。 溶解度：DNA和RNA均不溶于一般的有机溶剂（比如乙醇），微溶于水,但它们的钠盐在水中溶解度较大。 RNA Mr 104～106或更大 （二）粘度:可作为DNA变性(粘度降低)的指标 （三）酸碱性质及等电点 DNA的pI约为4～5， RNA的pI约为2.0～2.5， 在pH7～8电泳时泳向正极。 （四）紫外吸收 由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外有强烈吸收，最大吸收峰在260nm附近，利用这一特性可进行核酸的定量测定。 天然DNA 变性DNA 单核苷酸总吸收值 220 240 260 280 0.1 0.2 0.3 0.4 波长（nm） 光吸收 1 2 3 DNA的紫外吸收光谱 紫外分光光度法应用 1. 判断纯度 纯DNA：A260/A280=1.8 纯RNA：A260/A280=2.0 2.计算含量 若260nm光吸收值为 1 相当于50μg/ml双螺旋DNA 或相当于40μg/ml单链DNA或RNA 或相当于20μg/ml寡核苷酸。 3.判断DNA是否变性 在DNA的变性过程中，紫外吸收及摩尔消光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，紫外吸收及摩尔消光系数减小（减色效应） 增色效应（hyperchromic effect） 减色效应（hypochromic effect） 注意定义： （五）沉降特性 1．核酸浮力密度的测定 浮力密度：经密度梯度沉降平衡法测出的密度 RNA分离：蔗糖密度梯度 DNA分离：氯化绝（CsCl）密度梯度 加染料啡啶溴红进行染色，在紫外下，各条带显得很清楚 2．核酸的构象和分离关系 ρ：RNA环状DNA线状DNA蛋白质 超螺旋DNA或 （六）核酸的变性、复性 1．变性（denaturation） 在物理、化学因素影响下， DNA碱基对间的氢键断裂，双螺旋解开，伴有A260增加, DNA的功能丧失的过程。 引起核酸变性的因素: 1).外因: A热变性； B酸碱变性（pH小于4或大于11）； C有机试剂变性（尿素、盐酸胍、甲醛）等。 2).内因: A.碱基的含量 (AT易变性,GC不易)； B.DNA的均一性； C.碱基的顺序效应。 2 熔点（Tm） 定义：通常把热变性过程中A260达到最大值一半时的温度称为该DNA的熔解温度，用Tm表示。 3 影响Tm值的因素 ① DNA的均一性 ：均一性高，变性温度范围越窄 ② DNA中G-C对的含量： 核酸 G+C 组成越高者 Tm 越大 经验式: (G-C)%=(Tm-69.3)×2.44 ③ 盐离子强度：离子强度高，Tm高。 4 复性（renaturation） 指经加热变性的DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。 热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为退火(annealing)。 （1）复性 理化性质: ↓ 比旋光度↑ 粘度↑ 高于Tm值5℃ 生物活性得到全部或部分恢复 （2）影响复性的因素 1 DNA的浓度( 浓度大 易复性) 2 DNA片段的大小( 片断小 易复性) 3 温度 ( 低于Tm 25度 易复性) 4 重复序列（具有多重复序列DNA，复性快） （3）复性动力学－－一定条件下，复性的反应速度用Cot来表示 Co--为变性DNA原始浓度 mol·L-1 t --为时间，以秒表示。 Cot : 时的Cot值，即指复性完成一半时的Cot值。 （七）凝胶电泳 核酸研究中最常用的方法 优点：简单、快速、灵敏、成本低。 通过凝胶电泳 （1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。 （2）测定分子大小。 （3）估计核酸的构象。 凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应 1．琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis） 超螺旋最快，环型其次，线型最慢 2．聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis） 琼脂糖凝胶电泳在紫外光下显色 M：λDNA（ Ha