实验五 叶绿体的分离.docVIP

 山东大学实验报告 2013年3月12 日 姓名 李某某 系年级 同组者 科目 细胞生物学实验 题目 叶绿体的分离、纯化与荧光观察 学号 201100140000【实验目的】 1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法； 2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 【实验原理】 1.叶绿体分离原理 匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。 差速离心：颗粒在离心场中的沉降速度取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的密度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速度不同，先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等渗溶液中（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗 糖溶液）进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。 分离过程最好在0~5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。 2、差速离心 特点：1.介质密度均一； 2.速度由低到高，逐级离心。 用途：分离大小相差悬殊的细胞核、细胞器。 沉降顺序：细胞核—线粒体—溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高尔基体—核蛋白体。 可将细胞器逐步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。 3、密度梯度离心 密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中，这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种，速度沉降主要用来分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体。 叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的，由于具有这一重要功能，所以它一直是植物生物学、细胞生物学和分子生物学的重要研究对象，叶绿体是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。 4、吖啶橙 （1）探针特性 AO是三环杂芳香类荧光探针，既可以标记DNA，又可以标记RNA，用蓝光激发后能够发出绿、红两种荧光。 AO与核酸的结合分为强结合方式和弱结合方式两种：一种是嵌入核酸双链的碱基对之间，另一种是与单链核酸的磷酸发生静电间相互作用。 强结合方式：又称插入性方式，AO分子插入在双链核酸的碱基对之间，它们的结合能量为6—10kcal/mol探针，插入后的探针分子与核酸结合更加稳定，每插入一个AO分子，双链结构即发生26度旋转，这样在一个位点上就限制了AO分子与DNA的结合，其荧光发射峰为530nm，呈绿色荧光。 弱结合方式：即静电吸引结合方式，带正电荷的AO分子与带负电荷的磷酸根结合，每个磷酸根的位点上均可结合一个AO分子，最大结合率为1:1，这种结合方式主要是AO分子与RNA分子的结合，其发射波长为640nm，呈红色荧光。 AO与核酸的结合方式在低浓度下最佳，此时插入性结合方式占优势。 （2）AO的主要应用： 1.对细胞内单链或双链DNA/RNA定性和定量。 2.分析核酸内部结构及含核酸的细胞成分构象。 3.观察DNA凝胶电泳情况。 4．作为细胞内PH梯度显示剂，用来检测离子交换，钙离子通道的质子梯度变化等。 5、荧光的概念 光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态到基态时，可以电磁辐射的方式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。紫外辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。 荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并且立即退激发在极端的时间内能发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光称为荧光，一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。荧光分为自发荧光或诱发荧光（次生荧光、续发荧光、间接荧光）。某些物质受激发光照射后可直接发出荧光，如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光等，称为自发荧光。某些物质本身不发荧光，但它经荧光染料染色后，再通过紫外线照射同样也能发出荧光，这种荧光称为诱发荧光，如叶绿体被吖啶橙染色后可发橘红色荧光。 6、荧光的性质1.吸收光，必须有激发光源。 2.荧光波长激发波长（损失热能）。 3.荧光强度极小于激发光的强度。 4.有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光、淬灭剂等，先拍照后观察）。 5.荧光强度取决于激发光强度、被捡物浓度、荧光效率（在制作荧光纤维标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油）。 7、荧光显微镜的操作及注意事项 接通电源，打开启动装置开关； 按starter按钮3~5秒以启动激