实验六免疫组化.pptVIP

实验三 免疫组化检测AIF 在小鼠组织中的表达 实验目的 了解免疫组化的原理和用途。 掌握荧光免疫技术的操作过程和方法。 利用免疫组化方法检测AIF在小鼠脑中的表达，观察显示的信号 。 在抗体球蛋白分子上，连接某一个特定的、容易检测的分子或原子 (标记物)，利用标记抗体能与相应抗原结合的特性，通过标记物的检测，从而确定抗原的存在部位。 斑点ELISA (dot-ELISA) 标记抗体技术目前广泛应用的主要 荧光抗体、酶标记抗体和同位素标记抗体等。前二者主要用于抗原定位，而后者不仅可用于定性、定量，还可用于定位。 此外尚有铁蛋白标记抗体，主要用于免疫电镜的技术，在亚细胞水平上进行抗原定位。 荧光抗体技术 (Fluorescent antibody technique) 将荧光染料连接在提纯的抗体球蛋白分子上，这种用荧光染料标记的抗体，就叫荧光抗体。 抗体经过荧光染料标记后，并不影响其与抗原结合的能力和特异性。因此，当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出。 利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中的待检抗原特异结合， 采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光， 借助荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有无待检抗原或抗体。 荧光抗体是将荧光素（如FITC）与特异性抗体以化学方式共价结合而成。 常用于标记的荧光素：异硫氰酸荧光黄（FITC） 四乙基罗丹明（RB200） 四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC） 标记方法：搅拌法(适合大样品) 透析法(适合小样品) 标记抗体的纯化：透析法、层析分离法 实验材料： 小鼠组织 封闭用血清 PBS缓冲液 β-actin 抗体 荧光素标记二抗等 操作步骤 1．先在贴有随机样本切片的载玻片上画好蜡圈，将冰冻切片围在当中。 2．将载玻片浸于固定液中固定10-20min；。 3．于1×PBS中清洗3遍，每次3min； 4．用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 5．于1×PBS中清洗3遍，每次3min； 6. 向蜡圈中加入封闭血清，进行血清封闭（于电热恒温培养箱中37℃恒温孵育40min至60min）； 7．加入抗体等一抗，于4℃冰箱中过夜。 8. 第二天将载玻片从4℃冰箱中取出； 9. 倒掉载玻片上的抗体； 10. 立即放入1×PBS中浸洗3遍，每次3min； 11. 加入带有荧光标记的2抗； 12. 于电热恒温培养箱中37℃恒温孵育40min 13. 于1×PBS中清洗3遍，每次3min； 14. 向蜡圈中加入1至2滴甘油/PBS混合液 15. 盖上盖玻片，4℃保存，备用或镜检观察。 注意事项 ? 荧光免疫组化技术主要靠观察标本的荧光抗体染色结果作为抗原的鉴定和定位，因此标本的制作十分重要。 在制作标本过程中应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和包埋过程中不发生溶解和变性，也不扩散至邻近细胞或组织间隙中。 标本要求尽量薄些，以利抗原抗体接触和镜检。标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去，有传染性的标本要注意安全。 标本固定的作用不仅使细胞内蛋白质凝固，终止细胞内酶反应过程，防止细胞自溶，以保持细胞固有形态和结构， 更重要的作用是保存组织细胞的抗原性，防止标本从玻片上脱落，除去妨碍抗体结合的类脂，易于保存。固定标本的原则应不损伤细胞的形态、细胞内的抗原和细胞膜的通透性。  思考题 （1）观察试验结果，并加以分析。 （2）与免疫组化其他方法进行比较，探讨荧光免疫技术的优缺点。 * 实验原理： 荧光抗体技术的原理与方法 直接法 间接法 补体法 双标记法 直接法 间接法 补体法 双标记法 荧光显微镜 荧光显微镜使用原理 激发滤片（BG） 吸收滤片（OG） 标本 FITC吸收光峰值：490-495nm FITC发射光峰值：520-530nm BG：325-500 OG：410-650 激发滤片 吸收滤片 荧光滤镜使用原理 *