实验四液态奶中几种常见食源性病原菌的多重PCR检001.docVIP

实验二 液态奶中几种常见食源性病原菌的多重PCR检测 ????一、目的 ????掌握多重PCR反应的基本原理，以及应用多重PCR同时检测食品中沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等常见食源性病原菌的方法。????二、实验原理 ????多重PCR是在同一反应体系中加入多对引物同时扩增多条目的DNA片段的方法。采用本技术可同时检测多种病原微生物。在实验过程中，首先可以采用选择性增殖、离心沉淀、滤膜过滤等方法同时富集目标微生物，然后提取它们的DNA，再添加多对引物，同时扩增目标菌靶DNA的特异性序列，并用电泳法检测扩增结果。 ????本实验以食品中常见的沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为检测对象，选择沙门菌基因(编码侵染上皮细胞表面蛋白)、大肠杆菌户phoA基因(大肠杆菌的持家基因)和金黄色葡萄球菌nuc基因(编码耐热核酸酶)为PCR靶基因，采用多重PCR对这些基因进行同时扩增，以实现对这些微生物的同时检测。 ??? 三、仪器与试材 ??? 1．仪器与器材 ?? ?PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、台式离心机、微量移液器。 ?? ?2．阳性菌种、培养基、引物 ???(1)阳性菌种：沙门菌CMCC50051、大肠杆菌HZFS2001和金黄色葡萄球菌ATCC6538。 ?? (2)培养基：乳糖肉汤。 ?? (3)多重PCR引物：选择沙门菌衙invA基因(编码侵染上皮细胞表面蛋白)、大肠杆菌phoA基因(大肠杆菌的持家基因)和金黄色葡萄球菌nuc基因(编码耐热核酸酶)为PCR靶基因。 ?? ?3．溶剂与试剂 ?? ?PCR缓冲液、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、正向和反向引物、Taq?DNA聚合酶、TE缓冲液 (pH=8．0)、溴化乙锭(EB)、琼脂糖、DNA?Marker、10％SDS、蛋白酶K、氯仿一异戊醇(24：1)、酚一氯仿一异戊醇(25：24：1)、无水乙醇、营养肉汤。 ????4．实验材料???? 3～4种液体奶，各50mL。????四、实验步骤 ????1．增菌取10mL样品，加入90mL营养肉汤中，于37℃摇床(150r／min)培养16h。 ????2．DNA提取 ????(1)取上述增菌液10mL，以10000r／min离心5min，弃上清液后，加入565μL?TE缓冲液，用吸管反复吹打沉淀，使之重新悬浮。 ????(2)加入30μL?10％SDS和5μL?20mg／mL的蛋白酶K溶液，混匀，于37℃温育2h。 ????(3)加入等体积(600gL)的氯仿一异戊醇溶液，混匀，冰浴5：min，以14000r／min离心5min。 ????(4)小心吸取上清液(约300mL)至一新离心管中(注意不可吸到界面处的溶液)，加入等体积的酚一氯仿一异戊醇溶液，混匀，冰浴5min，以14000r／min离心5min。 ????(5)将上清液(约200／μL)转入另一新离心管中，加入0．6倍体积的异丙醇，轻轻混合，以12000r／min于4℃离心5min，弃上清液。 ????(6)加入70％乙醇洗涤1min，离心，弃上清液，离心管倒扣，风干后，加入50μL?TE缓冲液重新溶解沉淀作为PCR的模板DNA。 ?3．PCR反应体系与条件 ?(1)反应体系。按下列顺序配制PCR反应体系(25μL反应体系)： ddH2O? 15.5μL 10×PCR缓冲液 2.5μL dNTP(2．5mmol／L) 2.0μL 正向引物(20μmo1／L) 1.0μL 反向引物(20μmol／L) 1.0μL 模板 2.0μL Taq?DNA聚合酶(2U／μL) 1.0μL 总反应体系 25μL (2)反应条件： 95℃7min热变性； 95℃30s、55℃?30s、72℃30s，30个循环； 72℃延伸15min。PCR产物置4℃保存。 4．结果检测 取10μL?PCR扩增产物加2μL溴酚蓝混匀，以DNA?Marker作相对分子质量指示，用10％琼脂糖凝胶(含EB?05μg／mL)在80V电压下电泳35min，置凝胶成像系统中观察是否存在对应的条带。如果出现对应的条带，则认为存在对应的微生物；没有对应条带，则认为不存在对应的微生物。五、注意事项 ????1．在实验过程中应以阳性对照菌株与确定不含目标微生物的样品进行阳性与阴性对照实验。 ????2．引物设计应具有特异性，依靠引物设计软件进行设计，不同引物对所扩增产物的大小要能通过电泳或其他方法区分开；引物分装成多管，不宜反复冻融多次。 ????3．PCR循环条件应根据引物的Tm值和扩增片段长度以及PCR仪的特性来设定。 4