变异链球菌总蛋白质提取方法的比较研究.pdfVIP

变异链球菌总蛋白质提取方法的比较研究 1 1 1 2 2* 田晓蓓 ，何永红 ，孔祥丽 ，温艳丽 ，万呼春 1、四川大学口腔疾病研究国家重点实验室，成都 （610041 ） 2 、四川大学华西口腔医学院，成都 （610041 ） E-mail ：whcwcums@ 摘 要：目的 建立稳定、有效、简便的提取变异链球菌总蛋白质的方法。方法 收集的变 异链球菌分别采用超声、热裂解超声、反复冻溶超声与玻璃珠辅助反复冻溶超声四种方法破 碎细菌，用两种裂解缓冲液溶解细菌蛋白质，通过观察细菌破碎程度、测定提取蛋白质浓度 及蛋白质单向电泳图谱分析比较各提取方法的效果。结果 四种方法都可以有效裂解细菌， 其中起主要作用的是超声，裂解液Ⅱ（30mM Tris-Hcl ，7M 脲，2M 硫脲，4 ％CHAPS ，5mM PMSF ，pH 8.0 ）溶解蛋白质的能力强于裂解液Ⅰ（50mM Tris-Hcl, 0.3 ％SDS, 0.3 ％DTT ，pH 8.0 ），提取蛋白经丙酮沉淀后仍能重新溶于与双向电泳中一维等电聚焦所用上样缓冲液成 分基本一致的裂解液Ⅲ （15mM Tris-Hcl，7M 脲，2M 硫脲，1﹪DTT ，4 ﹪CHAPS ，pH 8.0 ） 中，蛋白质单向电泳图谱显示四种方法提取的蛋白质的条带分布基本相同。结论 以裂解液 Ⅱ作为裂解缓冲液，采用反复冻融超声的方法可以有效地提取变链菌总蛋白质，具有较好的 稳定性和重复性，且操作简单。 关键词：变异链球菌，蛋白质组，超声 中图分类号：R780.2 蛋白质组学是从探讨个体总蛋白质变化入手，研究环境因素变化对个体生命活动的影 响。变异链球菌（简称变链菌）是口腔龋病的重要病原菌之一，在口腔疾病防治研究中，变 链菌蛋白质组研究逐渐成为一个新的热点。对变链菌总蛋白质进行有效提取，是开展变链菌 蛋白质组研究的基础。国外有文献分别报道了几种变链菌蛋白质的提取方法[1-9]，但未见对 这些提取方法进行比较研究的报道。本文在参考国内外文献基础上，对几种变链菌总蛋白质 的提取方法进行系统的比较研究，期望建立一种有效、稳定、简单的提取方法，为进一步开 展变链菌蛋白质组研究奠定基础。 1. 材料和方法 1.1 实验菌株 变异链球菌（S. mutans ）ATCC 25175 ，由口腔医学国家重点实验室提供。 1.2 主要试剂 裂解液Ⅰ（50mM Tris-Hcl, 0.3 ％SDS, 0.3 ％DTT ，pH 8.0 ）；裂解液Ⅱ（30mM Tris-Hcl， 7M 脲，2M 硫脲，4 ％CHAPS，5mM PMSF，pH 8.0 ）；裂解液Ⅲ（15mM Tris-Hcl，7M 脲， 2M 硫脲，1﹪DTT ，4 ﹪CHAPS ，pH 8.0 ）；BCA 试剂盒（PIERCE ）；玻璃珠（Φ425～ 600um,sigma ）；实验用水均为超纯水。 1.3 主要仪器 超声破碎仪（SANYO，日本）；垂直电泳系统（BIO-RAD ，美国）；凝胶成像分析系 统（BIO-RAD 2000 ，美国），纯水仪（MILLPORE ，美国） - 1 - 1.4 实验方法 1.4.1 细菌培养和收集 将变链菌接种于TPY 平板，培养后挑取单菌落接种于300ml TPY 液体培养基，培养20h 后离心收集细菌，洗涤两次后重悬于 30ml 含氯霉素（100µg/ml）生理盐水中，室温放置 10min～15min，混匀等分为30 份，离心，细菌沉淀保存于-20℃，备用。 1.4.2 细菌裂解 方法1 （超声） 将保存的细菌沉淀于37℃水浴30min，加入1ml 裂解液Ⅰ，超声(11KHZ，10S×84 次循 环，间隔 1min，冰浴) ，振荡(5×30S，间隔1 分钟，冰浴) ，取10µl 混悬液涂片进行革兰氏 染色。剩余混悬液离心（