miR-21与Nocodazole联合作用对小鼠成肌细胞C2C12周期的影响.pdfVIP

遗德蘑种 ·GeneticsandBreeding 2015年 第51卷 第1瑚 miR一21与Nocodazole联合作用对小鼠成 肌细胞C2C12周期的影响 刘会杰 ，敖 红 ，白立景 ，王志军 ，邢 凯 ，王楚端 (1．中国农业大学动物科技 学院，北京 100193；2．中国农业科 学院畜牧兽 医研究所，北京 100193； 3．天津宁河原种猪 场，天津 301504) 摘 要 ：观 察miR一21与Nocodazole联 合 作 用对 小 鼠成肌 细 胞C2C12周 期 的影 响 。分 别 以0、200、300、400、 500、600nmolL／Nocodazole处理C2C12细胞24h，流 式细 胞仪 检测 细胞 周期 ．间接 免疫 染 色激 光共 聚焦显微 镜 观 察细胞有丝分裂器仅一微管蛋 白( 一tubulin)排列 。转染miR一21mimics／NC和inhibitors／NC，24h后 ，添加400nmol／L 的Nocod~ole处理24h，流式细胞仪检测细胞周期 。结果表 明：Nocodazole使C2C12细胞 同步化 的最佳 浓度是 400nmo1]L；过表达miR一21mimics之后 ，与对 照组相 比，Go／Gl，S期细胞百分 比极显著增加 ．G#M期细胞 百分 比极 显著减少 (P0．01)；添加抑制剂后 ，与对照组相 比，添加抑制剂 (inhibitors)的C2C12细胞 中处于G G期 的细胞 比 例显著高于对照组 ，而处于G2，M期 的细胞 比例显著低 于对照组细胞 (PO．05)；正反试验结果证 明，miR一21促进 C2C12细胞周期进入S期 。为进一步研 究miR一21对C2C12细胞 的作用机制奠定基础 。 关键词 ：Nocodazole；miR一21；C2C12：周期 ；小鼠 中图分类号 ：$865．2 文献标识码 ：A 文章编号 ：0258—7033(2015)01—0010—05 目前 ，肿瘤治疗 的中心环节是干扰肿瘤细胞 的 鱼)上发现 ，进入胚胎期l2h后就能观察到miR一21， 细胞周期 ，从而使肿瘤细胞增殖减慢或诱导其凋亡。 且 比例 占所有miRNA的40％t。miR一21可能调节骨骼 大量实验证据表明，许多抗癌药物对细胞周期有特 肌的发育，故本研究 以C2C12细胞的研究对象 ，观察 异的阻断作用…。Nocodazole，化学名 ；5一(2-硫碳基) miR一21对其细胞周期的影响。 1H一苯并咪唑一2y1]氨基 甲酸甲酯 ，它可以与微管结 l 材料与方法 合，干扰纺锤体的形成，使细胞阻滞在G2／M期。在研 究某一时刻细胞的代谢 、增殖 、基因表达或凋亡时， 1．1 材料及试剂 DMEM培养基 、胎牛血清、胰酶 可行的方法是用 同步生长的群体细胞动力学来反映 (GiBCO，美 国)；Nocodazole、DMSO (Sigma，美国)， 细胞的真实代谢行为。低浓度的Nocodazole(54nmol／L) Nocodazole用DMSO配制成5mg／L的母液，一20~C保存 基本不影响微管解聚，但对同步化没有效果[2]，高浓 待用；碘化丙啶(PI)(BD，美国)，抗 一微管蛋 白单克 度 的Nocodazole(10I~mol／L)可使细胞高度同步化， 隆抗体 (Ea~hOx，美国)，FITC标记山羊抗小鼠IgG(碧 但容易引起纺锤体全部解聚，最后导致细胞凋亡[引。 云天 ，A0568)；FACSplus流式细胞仪 (BectonDickinson， 目前 国内外的研究l4_】采用Nocodazole对不 同细胞进 美 国)；激光共聚焦显微镜FV100(Olympus，美 国)； 行GJM期同步化时使用的浓度和效果差异甚大。本 C2C12细胞株为本实验室冻存。 研究以C2C12~$胞为试验细胞株 ，确定Nocodazole用 1．2 细胞培养与分组 小鼠成肌细胞C2C12培养于 于C2C12细胞同