17α,20β双羟孕酮诱导鲤卵母细胞最终成熟相关基因表达内参基因的筛选.pdfVIP

中国水产科学 2014年 9月，21(5)：910—919 JournalofFisherySciencesofChina 研 究论文 DoI：10．3724／SP．J．1118．2014．00910 17a，2 双羟孕酮诱导鲤卵母细胞最终成熟相关基因表达内参基 因的筛选 史艳艳 ，卢洁2，王艺磊 ，王淑红 1．集美大学 水产学院，福建 厦门 361021 2．厦门大学 物理与机电工程学院，福建 厦门 361005 摘要：本研究检测了 18SrRNA(1SS)、28SrRNA(28S)、组织蛋白酶 Z(cathepsinz，CTSZ)、延伸因子 1-a(elongation factorl一Ⅱ，EF-la)、3-磷酸甘油脱氢酶(glyceraldehyde一3-phosphatedehydrogenase，gapdh)、 肌动蛋白 ．actin)6个候 选内参基因在 17a，2 双羟孕酮(DHP)诱导鲤(Cyprinuscarpio)~母细胞最终成熟过程的表达情况，并应用不同的 内参分析软件对数据进行 了分析。Bestkeeper软件分析表明EF-la的变异系数和标准差是 6个候选 内参基因中最 低的，且Bestkeeper指数在6个候选 内参基 因中最高，说明其表达稳定性最高，适合做为内参基因；geNorm软件分 析认为需要同时使用 EF-Ia和 CTSZ两个 内参基因来校正 目标基因的表达；NormFinder软件分析同样表明EF-Ia 是 6个候选内参基因中表达最稳定的；最后通过 RefFinder软件综合 比较分析，确定EF-la相对于其他 5个候选 内 参基因，在 17a，2off双羟孕酮诱导卵母细胞最终成熟阶段表达最为稳定，可作为内参校正17a，2 双羟孕酮诱导鲤 卵母细胞最终成熟阶段各基因的表达情况。 关键词：鲤；17a，2op双羟孕酮；基因表达；内参基因；卵母细胞最终成熟；实时荧光定量PCR 中图分类号：$917 文献标志码：A 文章编号：1005—8737一(2014)05—0910—10 鱼类卵母细胞在完成卵黄积累后停留在性腺 确L2J。检测参与该过程各基因转录本丰度的变化 发育的第 V 期，此时卵母细胞处于成熟晚期(full 是了解卵母细胞最终成熟分子机制的一个重要方 growth)，一旦光照、温度、异性等环境条件适合， 面。实时荧光定量 PCR技术(qantativereal—time 即进入卵母细胞最终成熟阶段 。该阶段虽然历时 PCR，qPCR)是一种实时监测 PCR扩增产物并进 很短，一般不超过 24h，但涉及生发泡破裂(ger． 行解析的定量方法，具有敏感性高 、重复性好 、 minalvesiclebreakdown，GVBD)、染色体凝集、 检测速度快 、自动化程度高等诸多优点，目前 已 减数分裂纺锤体的形成，以及第一极体的排出等 被国内外学者广泛应用 -8]。该技术一般需要用表 诸多过程 ]，这些过程的顺利完成是卵母细胞成 达稳定的内参基因对靶基因的表达情况进行校正 功受精的先决条件，任何环节受到影响都会导致 和标准化 。以往的研究多以表达量众多的管家基 繁殖失败L2J，种群补充受到影响。自 19世纪 80 因如核糖体 RNA18SrRNA或28SrRNA以及 年代，研究者进行了大量的研究，阐明了卵母细 动蛋白等作为内参。然而，大量的研究表明，这些 胞最终成熟的激素调节机制 [3-61,但最终成熟过 常用的内参基因在不同实验条件下的表达也有变 程中所涉及的分子事件及其相互关系至今仍未明 化[9 ¨。不稳定内参基因的使用会导致qPCR的结 收稿 日期 ：2013—10—21：修订 日期：2013．12．23． 基金项 目：集美大学创新团队基金项 目(2010A001)． 作者简介：史艳艳(1989一)，女，硕士研究生，主要从事水产动物遗传育种学研究．E—mail：syya03@gmail．tom 通信作者：王淑红，副教授，硕士生导师．E-mail：shwang@jmu．edu．cn 第 5期 史艳艳等：17a，20p双羟孕酮诱导鲤卵母细胞最终成熟相关基因表达 内参基因的筛选 911 果 现严重偏差。越来越