人LDHA原核表达、纯化及体外抑制剂筛选模型的建立.pdfVIP

第 54卷 第 l期 厦门大学学报 (自然科学版) Vo1．54 NO．1 2Ol5年 1月 JournalofXiamenUniversity(NaturalScience) Jan．20l5 人 LDHA原核表达 、纯化及体外抑制剂筛选模型的建立 金科华 ，吴昕瑞 ，王苗苗 ，宋思扬 (1．厦 门大学 生命科学学院，细胞应激生物学 国家重点实验室，福建 厦 门 361102； 2．湖北科技学院基础医学院，湖北 咸宁 437100) 摘要 ：在多数肿瘤细胞中高度表达的乳酸脱氢酶A(LDHA)与肿瘤的发生、发展和预后密切相关，筛选 LDHA小分子 抑制剂可提供一种富有潜力的靶 向抗肿瘤策略．本研究以pET一28a为载体 ，构建了人 LDHA表达质粒并于大肠杆菌 BI21(DE3)巾稳定表达 ，产量达到 2．65mg／I．基于 IDHA的催化反应建立 r以丙酮酸钠和还原型烟酰胺腺嘌呤二核 什酸 (NADH)为底物的筛选模 型．实验结果表明：模 型的 LDHA最适质量浓度为 60ng／mI，以质量分数 0．25 草酸钱 为阳性对照 ，筛选模型的 z因子为 0．812．至此 ，本研究建立 了 LI)HA抑制剂体外生化筛选模 型 ，其成本低 、可操作性 强 ，符合高通量筛选要求 ，为发现新颖 的 IDHA抑制剂奠定_r基础． 关键词 ：乳酸脱氢酶 A；表达；抑制剂；筛选模型 中图分类号 ：Q554．5 文献标志码 ：A 文章编号 2015)01—003605 乳 酸脱 氢酶 A(LDHA)是糖 酵解通路 中的重要 此 ，进一步发现选择性好、毒副作用低 的 II)HA抑制 酶 ，在多数肿瘤细胞中过度表达的 IDHA与肿瘤的发 剂具有重要 意义．本研究构 建 了 pET28a—LDHA 表 生 、发展和预后密切相关 。．正常细胞主要依靠氧化 达载体 ，并于宿主大肠杆菌 BI2l(DE3)中稳定表达 磷酸化产乍的 ATP，提供生命活动所需能量 ；而肿瘤 IDHA．基于 IDHA 的催化反应建立了以丙酮酸钠和 细胞 ，即使氧气充足，也主要依赖糖酵解产生 ATP【． NADH 为底物和检测反应体系 f)D 值为指标的筛 同时，糖酵解的中间产物为肿瘤细胞快速增殖提供核 选模型，其 Z因子达到 0．812，为开展 LDHA抑制剂 酸、蛋 白质合成的前体物质 ．I．DHA催化丙酮酸还 的高通量筛选奠定了基础． 原为乳 酸 的 同时将 还原 型烟 酰胺 腺 嘌呤二核 甘 酸 (NADH)氧化为NAD ．NAD 是 3一磷酸甘油醛脱氢 1 材料与方法 酶 (GAPDH)催化二三磷酸甘 油醛脱氢 的氢受体．抑制 IDHA活性 ，减少 NADH氧化为 NAD ，导致 GAP— 1．1 材 料 DH催化的反应因缺少氢受体而受阻，糖酵解不能继 1．1．1菌株 、质粒、基因及引物 续进行，进而导致 ATP水平降低，大分子合成所需前 大肠杆菌 TOP10、BI21(DE3)及 质粒 pET28a 体物质减少 ，起到抑制肿瘤细胞生长 、诱导其凋亡 的 为本课题组保存 ；人 LDHA cDNA 由韩家淮教 授惠 作用 ．因此 ，IDHA 小分子抑制剂可望成为新 的靶 赠 ；引物 由上海生丁生物工程公 司合成． 向抗肿瘤药物． 目前 ，已有少数 IDHA抑制剂报道_7 ，它们能有 1．1．2 主要试剂 效抑制肿 瘤细胞生长 ，但也存在特异性差 、毒副作用 ExTa