BVDV-2+E2基因克隆及其在毕赤酵母中表达.pdfVIP

第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集  牛病毒性腹泻是一种严重危害养牛业的传染病，为世界性分布。国内自李佑民于 1980 年首次从 流产胎牛分离出 BVDV 以来，有关本病的报道逐年增多。分子流行病学的研究表明，国内发生的牛 病毒性腹泻主要由 BVDV 基因 I 型引起。近几年，国内报道了牛群和猪群的 BVDV 基因 II 型病毒感 染，表明随着从国外的引种，及可能同时将基因 II 型 BVDV 引入国内。由于不同基因型之间和同一 基因型的不同基因亚型（Ia 和 Ib ）之间的BVDV 在抗原性上存在着较大的差异，因而，不同 BVDV 株在基因水平上差异，将为国内今后 BVD 的诊断和预防提出新的挑战。目前国内牛群存在着BVDV 基因 I 型和基因 II 型感染，而且每种基因型又可分为若干基因亚型，这种基因型的差异是否由于 BV DV 病毒长期进化、突变所致？为了进一步阐明基因型差异的机制，以便为国内 BVD 的防治提供依 据，我们重新从国内 BVD 首次流行的长春地区的疑似 BVD 的牛场分离了BVDV CC13B 毒株，并进 行了全长基因组序列的测定和分析。系统进化树分析的结果显示，本研究分离的 BVDV CC13B 属于 Ib 基因亚型，与德国的 CP7 株同源性最高，达到 96%，而与国内的 VEDEVAC 毒株的同源性最高， 但只有 89.6%，与我国最早分离到的 184 毒株，同源性只有 88.8%。某些毒株在图2-B 的进化分支位 置与图 2-A 有所不同，这可能是由于 NS2 这一区域在瘟病毒属内变异性较高所致；但在变异性较高 的NS2 区域，BVDV CC13B 与 VEDEVAC 、184 毒株都在同一分支内，进一步证明，BVDV CC13B 为 Ib 基因亚型。由于我国流行的 BVDV 毒株较为复杂，如 sichuan 株可能属于 BVDV-I 型中的新的基 因亚型，也可能属于新的基因型，但毒株之间一般具有一定的地域性，相同地区之间的病毒序列更加 接近，因此本研究发现的 BVDV CC13B 与德国 CP7 毒株的同源性最高，可能是由于近几年国内不断 从国外引进新品种牛，或使用进口高免血清时引入的。但同时由于 BVDV CC13B 与国内最早分离的 长春 184 株均来自于同一地区，且都属于 BVDV-Ib 基因亚型，所以该分离株也可能是由 184 毒株变 异而来。深入探讨 BVDV 的进化与变异及其机制将对BVD 的防治提供理论依据。 参考文献（略） * BVDV-2 E2 基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 1 1 1,2** 1** 2 1 1 1 刘昱成 ，王国超 ，孟庆玲 ，乔军 ，才学鹏 ，贺志昊 ，杨海波 ，陈创夫 （1. 石河子大学动物遗传改良与疾病控制新疆自治区重点实验室，新疆石河子，832003 ；2. 中国农业科学院兰州兽医 研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州，730046） 摘 要 根据GenBank 登录的BVDV-2 E2 基因序列，设计特异性引物，对BVDV-2 新疆SW 分离株E2 基因进行RT-PCR 扩增，克隆入T 载体中测序，然后亚克隆入酵母（P. Pastoris ）分泌型表达载体pPIC9K 中，构建重组表达载体pPIC9K-E2 。 用Sal Ⅰ酶切线性化重组质粒pPIC9K-E2 ，电转化P. Pastoris GS115 ，通过G418 筛选重组酵母菌GS115-pPIC9K-E2， 用1.5%甲醇诱导，SDS和Western blot 分析表达产物。SDS分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为 23.2 Kda ；Western blot 分析表明该重组蛋白可与BVDV-2 多克隆抗体发生特异性血清学反应，证实表达的重组E2 蛋 白具有良好的反应原性，为BVDV-2 诊断试剂研发奠定基础。 关键词 BVDV ；E2 基因；载体构建；真核表达 牛病毒性腹泻/粘膜病（Bovine viral Diarrhea/Mucosal disease, BVD/MD ）是由牛病毒性腹泻病 毒（