LR重组法构建重组腺病毒rAd5-Vpr.pdfVIP

TianjinMedJ，Nov2008，Vol36No11 LR重组法构建重组腺病毒rAd5一Vpr 冯学泉 徐 军 王金环 徐新女 王淑杰 摘要 目的：构建携带HIV一1Vpr基因的重组腺病毒。方法：采用限制性内切酶消化和T4DNA连接酶连接的方 法 ，将 Vpr基因克隆至腺病毒穿梭质粒pTrack—C上，然后通过重组穿梭质粒pTrack—C—Vpr和腺病毒骨架质粒 pAdeno体外LR位点特异性重组的方法，将Vpr基因转移至腺病毒骨架质粒pAdeno上，最后重组骨架质粒 pAdeno— Vpr鉴定正确后经PacI酶切，转染HEK293细胞 ，包装成重组腺病毒rAd5一Vpr。同时在HEK293细胞中进行病毒扩 增，利用 PCR方法对重组腺病毒进行鉴定，用微量全细胞病变法检测病毒滴度。结果 ：PCR鉴定重组腺病毒rAd5一 Vpr构建成功；扩增后检测病毒滴度约为5xlO。PFU／mL。结论：应用LR重组法能成功构建携带HIV一1Vpr基因的重 组腺病毒 ，扩增后滴度能满足实验需要 ，为进一步相关研究的开展奠定了基础。 关键词 腺病毒科 质粒 聚合酶链反应 HIV ConstructionofRecombinantAdenovirusCarryingHIV-1VprGeneviaLRRecombination FENGXuequan，XUJun，WANGJinhuan，XUXinnti，WANGShujie DepartmentofNeurosurgery,TheFirstCentralHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300192，China AbstractObjective：ToconstructarecombinantadenoviruscarryingHIV一1viralproteinR (Vpr)gene．Methods： First，bythemethodofrestrictionendonucleasedigestionandbyusingT4DNAligase，theHIV-1Vprgenewasclonedtothe shuttleplasmidpTrack-C，thenLR site—specificrecombinationwasperformedinvitrobetweenrecombinantshuttleplasmid pTrack-C-VprandadenovimsbackboneplasmidpAdeno．Finally，aftercorrectidentificationofhterecombinantbackbone plasmidpAdeno-Vpr,itwasdigestedbyPacIandtransfectedintoHEK 293cellsandpackagedoutrecombinantadenovirus rAd5-Vpr．Meanwhile，itwasamplifiedinHEK 293cellsandidentifiedbyPCR analysis．Thetiterwasdetectedbythe methodoftracetotalcytopathiceffect．Results：PCRidentificationshowedtheconstructionofrecombinantadenoviursrAd5一 Vprwassuccessfu1．Thetiterwasabout5x10PFUm／Lafteramplification．Conclusion：Therecomb inantadenoviruscarrying VprgenewasconsturctedsuccessfullyviaLRrecombination，thetiterafteramplificationmeetshteneedofexperiment，SOit laidaofundationforfurtherrelevantstudy． Keywords adenovirus plasmids polymerasechainre