08DNA重组.ppt

转座因子的存在，往往会引起宿主染色体DNA重组，造成染色体断裂、重复、缺失、倒位及易位等，是基因突变和重排的重要原因。 转座因子也可通过干扰宿主基因与其调控元件之间的关系或转座因子本身的作用而影响邻近基因的表达，从而改变宿主的表型。 (二) 真核生物的转座因子 最早发现能转移的遗传因子是玉米转座子，它对染色体基因有不稳定的诱变效应，因而影响某些遗传性状，故称为控制因子。 其后发现真核生物广泛存在各种转座因子。 真核生物的转座因子与原核生物转座因子十分相似；转座依赖于转座酶，转座因子的两端有被转座酶识别的反向重复序列，转座的靶位点是随机的，靶位点交错切开，插入转座因子后经修复形成两侧正向重复序列。 但是二者在结构和性质上也有一些差别。原核生物的转录和翻译几乎是同时进行的，真核生物由于核结构的存在而使此两过程在空间上和时间都被分隔开了。 因此，真核生物细胞内只要存在转座酶，任何序列片段具有该酶识别的反向重复末端均可发生转移，而无需由被转移序列自身编码这些酶。 这就可以说明，为什么真核生物的转座因子家族中只保留少数拷贝具有编码转座酶基因的活性，而多数拷贝中发生程度不同的删除，失去转座酶基因活性，但保留了两端的反向重复序列。 原核生物的转座酶主要作用于产生它的转座因子，表现出顺式显性(cis dominance)，真核生物则无此特性，这也是二者最明显的差别。 当DNA分子断裂时，它即结合在其游离端，使DNA双链解旋并降解，解旋所需能量由ATP水解供给。 及至酶移动到chi位点(5′GCTGGTGG3′),在其3′侧4～6个核苷酸处将链切开，产生具有3′末端的游离单链。随后单链可参与重组各步骤。 大肠杆菌基因组共有1009个chi位点，分布在DNA各部位，平均5kb有一个，成为重组热点。 由于DNA分子具有螺旋结构，在持续进行链的交换时需要两DNA分子发生旋转。RecA能够介导单链绕入另一DNA分子，并水解ATP。 一旦Holliday中间体形成，即由RuvA和RuvB蛋白促进异源双链的形成。 RuvA蛋白能够识别Holliday联结体(junction)的交叉点，RuvA四聚体结合其上形成四方平面的构象，使得分支点易于移动，RuvA还帮助RuvB六聚体环结合在双链DNA上，位于交叉点上游。 RuvB是一种解螺旋酶，通过水解ATP而推动分支移动(图4-4)。 RuvAB复合物的移动速度约为10～20 bp/s。同源重组最后由RuvC将Holliday联结体切开，并由DNA聚合酶和DNA连接酶进行修复合成。 RuvC是一种核酸内切酶，特异识别Holliday联结体并将其切开。它识别不对称的四核苷酸ATTG，此序列因而成为切开Holliday联结体的热点，并决定结果是片段重组还是拼接重组，即异源双链区两侧来自同一分子还是不同分子。 图4-4 Ruv AB复合物结合于Holliday联结体的模型 相当于原核生物中与重组有关酶的对应物也已在真核生物中发现。 在酿酒酵母中的rad51基因与大肠杆菌recA基因同源，二者的功能有关。该基因突变造成双链断裂积累，并且无法形成正常的联会复合物，但此蛋白质不能在体外与单链DNA形成纤丝，表明原核生物与真核生物的同源重组机制可能有所不同。 二、 特异位点重组 特异位点重组广泛存在于各类细胞中，起着十分特殊的作用，彼此有很大的不同。它们的作用包括某些基因表达的调节，发育过程中程序性DNA重排，以及有些病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合与切除等。 此过程往往发生在一个特定的短的(20～200 bp)DNA序列内(重组位点)，并且有特异的酶(重组酶)和辅助因子对其识别和作用。 特异位点重组的结果决定于重组位点的位置和方向。 如果重组位点以相反方向存在于同一DNA分子上，重组结果发生倒位。 重组位点以相同方向存在于同一DNA分子上，重组发生切除；在不同分子上，重组发生整合(图4-5)。 图4-5特异位点重组的结果依赖于重组位点的位置和方向重组位点以白箭头表示。A重组位点反方向位于同一DNA分子，重组结果发生倒位。B重组位点同方向位于同一DNA分子，重组发生切除；位于不同分子，重组发生整合 位点专一性重组最早是在λ噬菌体的遗传学研究中发现的。λDNA通过重组整合到大肠杆菌染色体的专一性位点上，转变成为原噬菌体DNA的非活性状态。 一般位点专一性重组都具有λ整合作用的两个基本特征： ①交换是相互的和保存原先的DNA，是典型的保守性重组（conservative recombination）； ②它发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列中的专一性核苷酸上，在高等生物细胞中，最重要的例子是通过一组前体序列的位点专一性重排构建多种多样的专一抗体基因。 λ噬菌体的整合与切除 λ噬菌体侵入大肠杆菌