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通用型双筛选标记打靶载体的构建 韩翠芹、邓捷、王华岩幸 陕西省干细胞工程技术研究中心、陕西省农业分子生物学重点实验室、西北农林科技大学 陕西杨凌712100 引言 基因打靶技术通过外源DNA与受体细胞染色体DNA同源序列之间的重组来改造基因组特 定靶位点，从而改变生物的遗传特性，是转基因动物研制的关键手段。早在1987年人们利 靶和体细胞核移植技术结合成功获得了转基因绵羊，为生产其他转基因大动物提供了思路。 但是，目前基因打靶存在的主要问题是所应用的基因打靶系统不完善。为此，本研究希望能 够建立～套切实可行的基因打靶载体系统，为开展动物转基因研究提供有价值的技术平台。 材料和方法 以pBS246质粒为骨架，将合成的两段富含8碱基酶切位点的多克隆位点序列以及单纯 疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因序列克隆到其两个LoxP序列左右，获得过渡载体 切检测确定后最终得到打靶载体pGT-V1，并对其测序。对构建好的打靶载体线性化后电转 染到C2C12细胞，24小时后观察荧光，G418稳定筛选得到对应克隆后收集细胞，以未转 染的细胞为对照，提取RNA进行RT-PCR检测。同时将部分克隆扩大培养后加入一定浓度 的丙氧鸟苷(GAC)，检测HSV-tk整合到基因组中是否表达。再者，为检测打靶载体上两 个LoxP位点是否工作，将表达Cre酶活性的pBSl85质粒转入阳性克隆细胞，流式细胞仪 检测报告基因被去除情况。 结果 以pBS246质粒为骨架构建的pGT-V1载体通过酶切和测序鉴定序列正确。利用电转染 方法将其转入小鼠C2C12细胞，可以观察到绿色荧光。经G418药物筛选，得到具有抗药 性的稳定转染的阳性克隆，用RT-PCR检测到了绿色荧光蛋白基因和新霉素基因的mRNA表 达。用GAC杀伤实验证明载体上HSV-tk基因工作，在基因打靶时能够将因为随机重组而 整合该基因的假阳性克隆全部杀死。将带有Cre酶基因的pBSl85质粒转入上述阳性克隆， 用流式细胞仪对荧光蛋白表达进行定量筛选，结果表明表达EGFP的细胞数量明显减少，从 而证明利用LoxP位点可以有效去除外源插入的报告基因。综上，本研究成功构建了通用型 双筛选标记打靶载体pGT-V1，并且在分子和细胞水平验证了其有效性。 讨论 传统转基因技术通常存在表达水平低和位置效应等弊端，应用基因打靶技术可以克服以 上不足，对动物基因组特定位点实现靶向修饰。本研究构建的打靶载体使用两个“8碱基” 多克隆位点，解决了打靶同源臂与载体连接时出现的酶切位点冲突的问题，使得该载体适用 于多种基因的打靶工作，具有通用性。在打靶载体中引入正负筛选标记，可以最大限度富集 中靶细胞，但是目前使用的多数打靶策略无法将中靶细胞中的筛选标记去除，使其永久整合 到细胞基因组上，这可能是造成体细胞克隆效率低下和克隆动物流产率、畸胎率较高的一个 原因。本研究构建的载体在两个LoxP序列之间插入NEO作为正筛选标记，同时再插入EGFP 序列，这样通过药物筛选获得阳性克隆后，转入能够表达Cre酶的质粒，通过观察绿色荧光 的变化，最终得到目的基因被敲除，筛选标记也被去除的靶细胞。本研究构建的打靶载体为 开展转基因动物研究提供了新技术平台。 致谢 本实验由国家转基因重大专项“转基因新技术新方法研究”(群2008zx080lO．001)资助。