西农萨能羊脂肪酸合酶乙酰%2f丙二酸单酰基转移酶区域基因重组腺病毒载体构建.pdfVIP

西农萨能羊脂肪酸合酶乙酰／丙二酸单酰基转移酶区域基因重组腺病毒载 体的构建 朱江江罗军赵旺生石恒波李君 (西北农林科技大学动物科技学院，陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌712100) 关键词：西农萨能羊；脂肪酸合酶乙酰／丙二酸单酰基转移酶区域基因；腺病毒：载体构建 引言 研究表明，羊乳的营养价值与其短、中链脂肪酸的含量较高紧密相关，反刍动物FAS基因的 MAT区域不仅具有转移酶活性，而且具有终止脂肪酸延长而形成中链脂肪酸的硫酯酶活性。泌乳期 反刍动物MAT能够终止碳链的延伸而特异性的生成并释放短、中链脂肪酸，由此可以推断山羊 MAT基因对山羊乳短、中链脂肪酸的合成起重要调控作用。因此，MAT基因功能的系统性研究对 从分子的角度提高羊奶的营养价值具有重要意义。Vangipuram MAT区域基因，并在大肠杆菌中表达，得到了具有催化活性的蛋白，说明MAT能够在体外单独 折叠为有活性的蛋白质。本研究在克隆西农萨能羊MAT基因的基础上，利用AdEasy系统构建该 基因的重组腺病毒表达载体，为下一步进行腺病毒的包装并在山羊乳腺上皮细胞中进行过表达，从 而进一步研究MAT的功能奠定基础。 材料与方法 以西北农林科技大学萨能羊原种场健康的纯种西农萨能羊(1．5岁，头胎，泌乳天数28d)为试 验材料，手术法采集乳腺腺泡组织样品。早晨常规屠宰后，立即采集29左右乳腺组织，用DEPC水 洗净样品表面残留的血液及杂质，迅速投入液氮中保存。利用Trizol一步法提取西农萨能奶山羊乳 设计引物。 MATFl： DQ915966．2) I线性化后，转化含有腺病毒骨架载 克隆及鉴定，连接腺病毒穿梭载体pAdTrack／CMV后，用Pme 体pAdEasyl的E．coliBj5183感受态细胞，进行腺病毒重组并鉴定。 结果 经过Pac I酶切，在4．5kb处有明显的条带，证明腺病毒重组成功，可以直接用于转染，从而过表 达MAT基因进行功能研究。 讨论 点，王海滨等完成了对西农萨能羊FAS基因exon9．15序列的克隆和序列分析，并预测其编码功 能蛋白的区域为95lbp，此区域包含了以上3个活性位点。本试验在其预测区域的基础上延长了克 隆的序列长度以保证包含MAT功能域的全部序列。测序结果表明，本次克隆结果与GeneBank收 录的序列有了～个碱基的差别，即601号碱基由G转变为A，并因此引起蛋白质序列Ala201转变 R等在牛FAS基因的exonl和exon34 为Thr201，而牛和小尾寒羊在此位点的碱基均为A。Roy exon 内各发现一个SNP。然而目前还没有发现针对FAS9．15的多态性报道，所以并不能排除在此 差异碱基处存在SNP位点的可能。根据重组的方式不同，重组腺病毒质粒PacI酶切鉴定也显示 出两种不同的结果，其条带出现在4．5kb处和3．0kb处都可认为其重组成功。 致谢 本研究受转基因生物新品种培育科技重大专项(2009ZX08009—162B)资助完成。