里氏木霉高吸附铜突变体构建和其功能的初步研究.pdfVIP

第一届伞国玉米有害生物控制技术学术研讨会 论文摘要集 里氏木霉高吸附铜突变体构建及其功能的初步研究 傅科鹤，范莉莉，胡晓璐，刘力行，陈捷幸 (上海交通大学农业与生物学院，农业部都市农业(南方)重点开放实验室) 在玉米生产过程中拮抗木霉菌经常要遇到各种理化逆境因子，从而影响生物 防治效果，其中重金属污染就是其中之一。因此研究木霉菌耐受和吸附重金属机 理，对于今后创制耐受逆境或兼具修复土壤的生防菌剂，或研究木霉菌剂与含重 金属的化学农药混用技术均具有重要意义。 本研究以里氏木霉为出发菌，通过一种改进的农杆菌介导转化(ATMT)方法， 构建罩氏木霉突变体库，筛选高吸附铜突变株；同时，通过生物信息学方法分析 里氏木霉基因组信息，寻找铜吸附相关基因。从1800多株突变体中找到一株高 吸附突变株A01，铜吸附特性研究表明：当培养基铜离子初始浓度为0．7mM，‘ 初始pH值为5．0时，菌株AT01的铜吸附率达到了96．1％，而野生菌的吸附率仅 为48．6％；同时，AT01的菌体颜色呈现明显的铜绿色，表明细胞吸附大量的铜 离子。透射电镜观察表明，铜进入胞内后，主要累积在液泡中。SouthernBlot分 析发现该突变株为T—DNA单拷贝插入，通过反向PCR扩增插入位点侧翼序列 发现T—DNA的右边界全部丢失，而左边界完整。初步分析插入位点基因情况， 发现T—DNA插入在一个基因家族的两个功能基因之间，并未直接破坏功能基 因。下一步实验将通过基因敲除、原位互补及荧光定位等技术分析基因能。 生物信息学分析找到3个与铜吸附相关基因：TM、Ctr2、Ctr3。其中TM基 因编码转录因子，调控胞外低浓度铜胁迫下跨膜通道蛋白(铜吸附相关)表达， 从而促进细胞铜吸附以维持胞内铜正常浓度。ATMT介导基因敲除实验表明，敲 mM 除子ATM培养在含O．2BCS(铜螫合剂)的YPDA培养基时生长受到明显 限制，菌落直径仅为野生菌的18％，说明该基因的敲除导致其调控的功能基因表 达量明显下降，从而影响细胞铜吸附能力，基因互补发现功能得到恢复。荧光定 位表明，培养基添加BCS后，TM编码蛋白得到表达，初期在核内，然后转移 到胞壁与某些通道蛋白结合。Ctr2、Ctr3为铜吸附相关功能基因，基因敲除表明， 基金项目：国家高技术研究发胜计划(2006AAl02408) 通讯作者：陈捷，教授，主要从事环境微生物工程研究；E-mail：jieehen59@sjtu．edu．en 第一作者：傅科鹤(1976-)，男，江西南昌人，博士生，研究方向：环境微生物工程研究； E-mail：fkh01 12@sjtu．edu．gn 第一届全国下米有害生物控制技术学术研讨会 论文摘要集 敲除子err2铜吸附能力比野生菌降低20％，而aCtr3吸附能力变化不明显。 敲除子ACtr3荧光定位互补表明，该基因编码蛋白主要在细胞壁。下一步实验将 通过通过酵母单杂、基因芯片技术寻找其调控的下游功能基因，以期深入研究木 霉菌铜吸附机制，揭示木霉菌铜代谢调控网络。 关键词：里氏木霉菌；铜吸附；ATMT突变株；生物修复