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2010,VOLUME12,NO.1ANIMALBIOTECHNOLOGYBULLETrN 18l
C
elegansfa扣J基因克隆及其家兔表达载体构建+
周红梅,徐宁迎,郭晓令
10029)
(浙江大学动物遗传育种与繁殖实验室,杭州3
引言
Fat.1基因编码的∞.3P切认s脱氢酶对生物体中∞.6PUFAs进行脱氢反应,生成相应的
∞.3PUFAs。tO.3
PUFAs已被证实在预防和治疗冠心病、糖尿病、促进胎儿脑细胞发育、提
高青少年记忆力等方面有重要作用。然而哺乳动物及人自身均不能合成∞.3PUFAs,只能从
食物中获取。2004年Kang等首先研制成功转向卜,基因小鼠,2006年Lai等研制成功富含
∞.3 PUFAs的转向f-,基因克隆猪。这些成果的诞生启发人们可以用同样的方法生产出富含
tO.3
PUFAs的动物性产品,为改善人类食谱提供了一个良好的思路。家兔作为一种用途广泛
的经济动物和实验动物,具有繁殖速度快、生产周期短等优点,且兔肉蛋白质含量显著高于
猪肉、牛肉和羊肉,脂肪多为不饱和脂肪酸,是老人、儿童、肥胖人群及动脉粥样硬化患者
等较好的肉食。但目前关于转向f-J基因家兔的研究尚未见报道。为进一步提高兔肉的品质
和利用价值,本研究从秀丽隐杆线虫(Celegans)中克隆获得肠卜』基因,并根据家兔基因
密码子使用偏好性,优化改造屈f.j基因,构建了向卜,基冈家兔表达载体和未优化的庙f-J,
基冈真核表达载体,为进一步培育研究转向卜』基因家兔新品系奠定基础。
材料方法
Tissue
用C.elegans生理溶液洗脱培养4~5天的虫体,按RNApreppure Kit方法提取总
RNA。通过RT.PCR技术扩增获得fat.1基冈编码序列。同时,根据家兔密码子偏好性,对
fat.1基因编码序列进行优化改造。将优化前后的fat.1基因与克隆载体连接,转化获得重组
克隆质粒。重组子再经双酶切后所得的目的基因片段定向克隆入绿色荧光蛋白真核表达载体
pEGFP.CI,经PCR、限制性内切酶酶切分析和测序鉴定构建的真核表达重组载体。
结果
构建的真核表达重组载体经Invitrogen公司测序,结果通过DNAMAN软件分析,痃扣?
基因家兔表达载体中目的基因与预先优化改造的屈f-J基因序列相比,identity=100.00%,
gap=0.00%,且读码框正确,与历f-.『基因编码的t,0.3PUFAs脱氢酶氨基酸序列一致,可用
于下游实验。未优化的屈f.,基因真核表达载体中目的基因与GenBank发表的向扣J基因序
列(登录号:NM001028389)比对,
identity=99.83%,gap=0.00%,但未发生移码现象,
可能为有意义突变,有待于进一步验证。
讨论与结论
载体的正确选择和构建作为提高外源基因在宿主细胞中高水平表达产物产量的重要环
节,本实验选择了能在哺乳动物细胞中高效表达并易于检测的pEGFP—C1载体作为危卜』基
冈转入家兔细胞的工具。同时,根据家兔基因密码子偏好性,优化屈卜J基因,并在优化后
的基冈起始密码子前加入Kozak序列,以使向卜,基因能在家兔体内高效表达CO.3PUFAs。
另外,在鉴定重组载体的过程中,阳性克隆的筛选与鉴定是一项重要的工作,本实验采用载
体多克隆位点两端通用引物结合插入片段特异性引物进行菌液PCR的方法筛选阳性克隆,
以提高初步鉴定阳性克隆子的准确率,达到节省时间且经济简便的目的。总之,本实验成功
构建的真核表达重组载体在科研理论及为进一步培育转基因家兔新品系实际应用研究方面
均具有重大意义。
基金项目:国家“863”项目(2007AAIOZlAl)
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