人α-乳清蛋白基因克隆与真核表达载体构建.pdfVIP

人Q一乳清蛋白基因克隆和真核表达载体构建 党文庆 徐宁迎 浙江大学动物遗传育种与繁殖实验室，杭州310029 ’关键词：人Q一乳清蛋白基因，母乳，表达载体构建，转基因猪 引言 a．乳清蛋白是分子量小、酸性的Ca2+结合蛋白，它几乎存在于所有的哺乳动物乳汁中。多数a． 乳清蛋白含有123个氨基酸，其中包括人、牛、羊、兔等物种，一般该基因的转录单元长度都在2Kb 左右，包括4个外显子。Q．乳清蛋白由乳腺上皮分泌，是人乳中重要的组成成分，约占总蛋白含量 的28％，占乳清白蛋白含量的49％，所以它在泌乳中起着关键的作用。在乳腺分泌细胞中，仅．乳清蛋 白是乳糖合成酶的一个组成部分，葡萄糖存在条件下，与半乳糖甘转移酶结合在一起，调节该酶的专 一性，因此a一乳清蛋白被认为具有通过控制乳糖的合成而间接影响乳产量及乳组成的功能。而母乳是 仔猪生长发育的基础，不仅给仔猪提供营养，还富含免疫球蛋白，能提供被动免疫，对抗病原菌，因 此高母乳品质对于养猪业的发展影响重大。培育高母乳品质的转基因猪可以解决现在母猪饲养面l临的 母乳数量不足和质量下降，初乳数量不够和母源抗体降低等问题。为了进一步提高母猪的母乳品质， 本研究克隆出Q．乳清蛋白基因的编码序列，构建了携带Q．乳清蛋白基因的真核表达载体，并在猪胎 儿纤维细胞进行了转染实验，为进一步培育研究转基因猪新品种奠定基础。 材料方法 从公司购买人Q．乳清蛋白基因的cDNA，根据已公布的人Q一乳清蛋白基因序列设计特异性引物， ORF序列。将该序列与克隆载体PMDl9．T连接， 通过PCR技术扩增获得人Q．乳清蛋白基因的429bp 转化获得重组克隆质粒。重组子再经双酶切后所得的目的基因片段定向克隆入绿色荧光蛋白真核表达 载体。利用阳离子脂质体介导法转染培养的猪胎儿成纤维细胞，从转染后12h开始观察细胞发绿色荧 光的情况。 结果 体中的目的基因与GenBank发表的人Q．乳清蛋白基因序列(登录号：NM002289)比对， identity= 99．80％，gap=0．00％，且读码框正确，说明克隆的是目的基因的全部编码序列，可用于下游实验，但 未发生移码现象，可能为有意义突变。转染后在荧光显微镜下观察只有少数细胞表达了绿色荧光蛋白， 还有待于进一步验证。 讨论 载体的正确选择和构建作为提高外源基因在宿主细胞中高水平表达产物产量的重要环节，本实验 细胞的工具。同时，在鉴定重组载体的过程中，阳性克隆的筛选与鉴定是一项重要的工作，本实验采 用载体多克隆位点两端通用引物结合插入片段特异性引物进行菌液PCR的方法筛选阳性克隆，以提 高初步鉴定阳性克隆子的准确率，达到节省时间且经济简便的目的。脂质体法是目前公认效率较高且 使用广泛的一种转染方法，转染时不同脂质体浓度、DNA浓度和转染时间都影响细胞的转染效率。 la 本实验选取的成纤维细胞的密度为80％．90％，DNA量为O．8．1．0 h后效率最高。 g，转染时间取48 总之，本实验成功构建的真核表达重组载体在科研理论及为进一步培育高母乳品质转基因猪新品种培 育的实际应用研究方面均具有重大意义。 致谢 本研究受国家转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08006．009B)资助。