2型猪链球菌毒力因子gapdh基因的克隆、表达和细胞互作蛋白的初步寻找.pdfVIP

国家星火培训计划及国家农业行业科技：第十届全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会论文集 113 2型猪链球菌毒力因子gapdh基因的克隆、表达 及细胞互作蛋白的初步寻找水 袁芳艳¨，谭臣，雷丽，陈焕春，贝为成¨· (华中农业大学动物医学院预防兽医学实验室，武汉，湖北，430070) 摘要2型猪链球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyeeraldehyde-3一phosphatc 分解酶，负责将磷酸甘油醛GAP磷酸化产生l，3．二磷酸甘油酯DPG，通常存在于细菌胞浆中。细菌表面的 多功能GAPDH蛋白可能与细菌毒力密切相关。为寻找宿主细胞表面与GAPDH相互作用的受体蛋白，以期 扩增gapdh基因，扩增片段大小为1011 大小约为41kDa的融合蛋白GAPDH，与预期结果相符。通过Westernblot检测，证实GAPDH具有良好的免 染的模型细胞之一，因此，本研究提取THeLa细胞的总蛋白，运用配体重叠技术(1igand-overlayapproach)， 初步寻找到了一个可能与GAPDH蛋白作用的受体蛋白，为进一步研究2型猪链球菌的分子致病机理奠定了 的基础。 关键词2型猪链球菌；GAPDH；克隆；表达；多抗制备；受体 2型猪链球菌甘油醛一3-磷酸脱氢酶(glyeeraldehyde-3-phosphate 酶，负责将磷酸甘油醛GAP磷酸化产生l，3．二磷酸甘油酯DPG，通常存在于细菌胞浆中。电子显微镜证实 链球菌表面存在GAPDH。目前对链球菌感染最初阶段的有关机制和细菌结构知识的了解还很有限。细菌 表面的多功能GAPDH蛋白可能与细菌毒力密切相关。另一方面，GAPDH表面定位机制还不清楚。因此， 寻找与GAPDH互作的受体蛋白对于揭示2型猪链球菌致病性有重要意义。 1．材料与方法 体。提取细胞总蛋白提取，运用运用配体重叠技术筛选与GAPDH相互作用的细胞蛋白质。 2．结果与分析 2．1gapdh基因扩增及蛋白表达、多克隆抗体制备 PCR反应后产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，出现一条扩增片段大小约为1011bp的带，大小与预期结果 blot的 结果表明，大肠杆菌中表达约41kDaGAPDH蛋白具有免疫学活性，进一步制备了该蛋白的兔抗多克隆抗体。 2．2GAPDH细胞受体蛋白的寻找 114 国家星火培训计划及国家农业行业科技：第十届全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会论文集 将提取的HeLa细胞总蛋白进行SDS．PAGE电泳检测后，再转硝酸纤维素膜，Westernblot实验结果筛 选了一个可能的所要寻找的受体蛋白。如要进一步研究确证该蛋白就是GAPDH相互作用蛋白，必须将该 蛋白进行质谱测序，并通过酵母双杂交、免疫共沉淀等方法加以验证。 参考文献：(略)