利用HIV-1+TAT融合表达4个转录因子蛋白重编程人成纤维细胞.pdfVIP

细胞工程与转基因 利用HIV-1TAT融合表达4个转录因子蛋白重编程人的成纤维细胞 潘传英1,2，卢柏松2，陈宏1，ColinEBishop2 1’西北农林科技大学动物科技学院，陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌712100； 2。WakeForestInstitutefor Forest Salem,NC27101，USA RegenerativeMedicine，WakeUniversity,Winston 关键词：诱导多功能干细胞(iPS)；TAT多肽；转录因子；基因表达；重编程 引言 将体细胞转化为诱导多功能干细胞(iPS细胞)是近年来干细胞研究的热点领域。但由于外源转录因子的 导入多数通过病毒载体介导，而病毒载体在靶细胞基因组随机整合，这又带来了人们对iPS安全性的顾虑，限 制了其临床应用的前景。细胞脂质双分子层的特殊结构限制了大分子物质在细胞内外的进出，而小的阳离子 是PTD家族中的一员。基于此，本研究以人的成纤维细胞为靶细胞，利用HW-1TAT融合表达4个转录因子蛋 白(Oct4、Sox2、Lin28和Nanog)，以期得到生物安全的诱导多功能干细胞。 材料方法 性的转录园子cDNA的上游；(2)蛋白表达纯化：质粒转导大肠杆菌后，利用IPTG诱导融合蛋白表达，再通 过一系列操作获得纯化的变性蛋白；(3)蛋白转导：一定量融合蛋白直接添加到IMR90的无血清培养基中， 37℃孵育一定时间后，细胞经短时间酸处理以除去其表面黏附蛋白，Western Blotting检测蛋白在细胞内富集 时间和剂量依赖性，同时免疫组化染色鉴定融合蛋白细胞内定位。(4)荧光素酶活性检测。 结果 SDS．PAGE和考马斯亮蓝染色结果证明，4个融合蛋白能在IPTG的诱导下进行成功表达；Westernblotting 进一步证明，所表达蛋白具有特异性；同时发现8h和40nmol／L是融合蛋白的最长有效作用时间和最佳作 用剂量；免疫组化染色发现，融合蛋白跨过细胞膜进入细胞后，并没有进入到细胞核而是聚集在核周的位置。 而荧光素酶的活性检测也证实融合蛋白没有相应的生物活性。 讨论与结论 本研究旨在探讨利用TAT融合表达4个转录因子蛋白和大肠杆菌表达系统来重编程人的成纤维细胞，以 够进入哺乳动物细胞并正确折叠成有生物活性的蛋白。本试验中的4个TAT转录因子融合蛋白都能穿透细胞 膜进入到细胞内，却不能到达细胞核，不能正确地折叠成有生物活性的功能蛋白。考虑到可能是内涵体“拦截” 了这些蛋白，我们利用HA2一TAT多肽去打开内涵体，帮助融合蛋白的释放，但未能得到显著的效果。由于 TAT介导大分子蛋白进入细胞内的机制并不清楚，而更多的研究也趋向于认为TAT融合蛋白在细胞内能否正 确折叠取决于TAT所介导的靶分子自身的生物学特性。由于本试验所涉及到的都是功能和结构相对复杂的转 录因子，有可能细胞内的作用机制只适用于一部分结构和功能相对比较简单的大分子，而对结构复杂的转录 因子却爱莫能助。这也解释了ShengDing课题组利用多聚精氨酸融合同样组合的转录因子蛋白，需要在体外 复性后再作用于靶细胞方能成功诱导iPS细胞的出现。目前，我们正致力于蛋白的体外复性和正确折叠。我 们相信，这个问题的解决有助于我们得到生物安全的人源iPS细胞。 致谢 本研究由美国国立卫生研究院(R21RR025408)资助，潘传英受国家留学基金委资助。 ·—‘193。-‘