细胞生物学4课件.pptVIP

一、细胞计数及活力测定二、细胞冻存三、细胞种玻片（分裂指数用）四、种MTT所需细胞 一、细胞计数及活力测定 （一）原理 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。 （二）仪器、用品与试剂 1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管 2、试剂：0.4％台盼兰 3、材料：细胞悬液 附：0.4%台盼兰染液配制 台盼兰 0.4克 加双蒸水至100 ml。 （三）操作步骤 细胞计数 1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算： 4大格细胞总数 细胞数/ml ＝ ×10000 4 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。 细胞活力 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2-3分钟。 3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。 4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。 活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。 二、细胞的冻存 （一）原理 在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。 目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。 （二）试剂和器材 器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等 试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液） 附：冻存液配制 培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达5-20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。 （三）操作步骤 1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。 2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。 3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。 4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。 5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。 6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。 7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。 注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。 三、细胞种玻片（分裂指数用） 1、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。 2、CO2培养箱中培养，使细胞长在盖玻片上。 四、种MTT所需细胞 1、消化细胞，加适量完培终止，转移至10ml离心管中。 2、接种96孔板，每孔体积100ul，每组可接种10个复孔。 实验顺序 1：取1瓶细胞消化，加3-4ml完培终止，接种至含有玻片的平皿中。 2：另取1瓶细胞消化，加3-4ml完培终止，接种96孔板，每孔体积100ul，每组可接种10个复孔。剩余细胞平均分到2个培养瓶中继续培养。 3：最后1瓶细胞消化，加3-4ml完培终止，将细胞悬液转移至10ml离心管中，吹打均匀。 4：取0.5ml细胞悬液至一1.5ml塑料离心管中，加等量台盼兰染液进行染色和计数。 5：剩余细胞悬液离心取沉淀，加1ml冻存液吹打，转移至冻存管中。 * * 实验三 *