禽黄病毒套式RT-PCR检测方法建立应用.pdfVIP

2012年第六届南京农业大学畜牧兽医学术年会论文集 禽黄病毒套式RT—PCR检测方法的建立及应用 黄欣梅，赵冬敏，刘宇卓，张敬峰，韩凯凯，李银 (江苏省农业科学院兽医研究所／农业部兽用生物制品工程技术重点实验室／ 国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京210014) 摘要：禽黄病毒病是新发的可引起鸭、鹅和鸡等家禽产蛋和采食量下降及死亡的一种疫病。本研究旨在建立一种快速诊断方法用于临床诊断及 Premier5 流行病学调查。根据GenBank发表的鹅黄病毒JS804株全基因序列，应用Primer0软件设计了2对特异性引物，建立了禽黄病毒套式 RT．PCR检测方法。结果：该套式RT．PCR方法具有特异性强，敏感性高的特点，最低病毒检测量为10“”TCID50／0．1mL，比普通RT．PCR方法 敏感性高1 诊断和流行病学调查。 关键词：禽黄病毒；套式RT．PCR；检测 2010年4月以来，我国大陆东部地区饲养的鸭、为国产分析纯产品。 鹅暴发了一种新的疫病，造成肉鸭、肉鹅大批死亡， 1．3引物设计与合成 种(蛋)鸭、种鹅产蛋大幅降低甚至绝产，给鸭鹅 Premier 养殖业造成重大的经济损失。本实验室通过病原分 序列(登录号JF895923)，应用Primer5．0软 离、电镜观察和序列分析，鉴定出引起此次疫病的病 件设计了2对特异性引物，其中Pl、P2为外套引物， 原是黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirus)扩增目的片段长度为985bp；P3、P4为内套引物， 病毒¨J，现将该病毒暂命名为禽黄病毒。面对一种 扩增目的片段长度为533bp。引物序列如下：P1： 5’一TACAC- 全新的传染病，急需建立一种快速、特异、灵敏的检 5’一T1TGqTCGGAAAGGGGAG一3’，P2： 测方法，这对及早发现并防止该病传播具有十分重要 CCCCAACTGAGCC一3’。P3： 的意义。传统的病毒分离和血清学诊断方法虽准确、 可靠，但所需时间长，不能满足临床快速诊断的需 物由南京金斯瑞公司合成。 要。国内有报道RT．PCR方法可从禽黄病毒中扩增出1．4病毒核酸的提取 目的片段H。J。但当病毒含量较低时难以检出，不能 鹅黄病毒JS804株、H9亚型禽流感病毒、鸭肝 直接用于临床病料的检测。本研究建立了禽黄病毒套 炎病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性 式RT—PCR检测方法，旨在满足临床快速准确诊断禽法氏囊病病毒，按照RNAisoplus试剂盒说明书提取 黄病毒病的需要，为该病提供更为敏感和特异的诊断 总RNA；小鹅瘟病毒，按照组织DNA提取试剂盒说 手段，以便更有效地控制该病的发生与流行。 明书提取DNA。 1．5套式RT-PCR方法的建立 1材料与方法 1．5．1反转录 1．1病毒与细胞 xAMVBuffer 鹅黄病毒JS804株、鸭肝炎病毒(DHV)、H9亚合成cDNA，反应体系为：5 4．0“L， A 10．0mol／LdNTP2．0 U 型禽流感病毒(H9IV)、薪城疫病毒(NDV)、传 IxL，随机引物25pmol，20