大肠杆菌ptsG基因的敲除和其对phe生产的影响.pdfVIP

大肠杆菌ptsG基因的敲除及 其对phe生产的影响5 吴伟斌2 黄钦耿2 施巧琴1,2 吴松刚1,2 1工业微生物发酵技术国家工程研究中心{福建师范大学}福州 2福建麦丹生物集团有限公司福州研究中心 福州 [摘要]L-phe是重要的食品和医药中间体，利用大肠杆菌发酵葡萄糖生成phe时，对葡 糖糖转运起重要作用的磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统(PTS)对phe产量合成有很大影 响，在大肠杆菌PTS系统中，葡糖糖主要由ptsG基因编码的葡萄糖特异性转运蛋白EⅡCB610 转运入细胞，通过基因敲除技术获取pts缺陷菌株，可以减少菌株对葡糖糖的摄取速率，减 少乙酸的生成，利于菌株的高密度发酵和重组蛋白和相关代谢中间物获得。采用Red同源重 组技术将大肠杆菌染色体上的ptsG基因进行敲除，得到PTS缺陷菌株。该菌株在以葡萄糖为 唯一碳源的培养基中摇瓶培养，菌密度为对照菌株的0.35倍，phe产量提高12％. [关键词]RED重组系统；基因敲除;聚合酶链反应；pstG基因 II 主要有两种策略：一是敲除葡萄糖特异性转运蛋E CBk(ptsG编码)，另一策略 l I et I er P和Gk途径((]osset 是敲除ptsHr操纵子．使葡萄糖转运依赖于Ga eI．2005)。 由于PTS转运葡萄糖速率过快会产生大量丙酮酸．使得细胞碳代谢速率不 平衡．导致乙酸等不利于菌体生长的物质大量积累．抑制菌体生长。PTS缺陷菌 株葡萄糖吸收速率较慢，可减少乙酸积累．使菌体生长代谢更加平衡、有效． 菌体生长状况更好．发酵产物积累更多【．利用代谢工程技术，构建PTS系统缺 陷株，能够很大程度地降低葡萄糖的摄取速率，由此可望降低乙酸的累积，促 进菌体生长。本文采用RED同源重组技术敲除大肠杆菌ptsG基因，对基因缺陷株 进行了初步研究。 Red同源重组技术的原理是将一段含标记基因的PCR片段导入宿主菌细胞， 该PCR片段两端分别携带着与靶基因两翼同源的序列。在噬菌体Red重组酶 (Exo、Beta和Gam3种蛋白)的作用下．线性标记基因DNA片段与宿主细胞染色 体上的特定靶序列发生同源重组。靶基因被标记基因置换下来．达到敲除基因 的目的． 1材料和方法 1．1材料 1．1．1菌株和质粒 E．COI．JMl I．K-1 09为本实验室保存菌株。E．CO2酪氨酸营养缺陷型菌株为本 实验室构建菌株。克隆载体pMD-18T为上海生物工程技术服务有限公司产品，表 3质粒． 的pkd46、pcp20、pkdl 1．1．2引物 旺D-pt CTGCTT GTCGAC 3kan—F：5一ATGATTG从C从GATGGATTGCAC一3 pKDl 3kan-R：5-TTAG从GAACTCGTC从GAAGGCG-3 pKDl 1．1．3试剂 相关酶、酵母提取物和胰蛋白胨为上海生物工程技术服务有限公司产品， 其他试剂均为国产分析纯。 1．1．4培养基 LB培养基(1000 10 extract5 10 m1)：Trytoneg，Yeast g，NaCIg， ml，2N mill，加入15 加水至930 NaOH调pH7．0，定容至1000ml。15磅灭菌30 g 琼脂即为固体培养基，37℃培养。培养基中使用抗生素时：氨苄青霉素终浓度 ll 为100g／m1．卡那终浓度为50uI／m1． 发酵培养基(内部姿料略) 1．2方法 1．2．1 ptsG基因的敲除组件的构建 根据NCBI公布大肠杆菌的基因组序列，