α-硫辛酸对大鼠肝脏缺血再灌注后缺血型胆道病变防治作用实验研究.pdfVIP

缸遗外辞 《一硫辛酸对走鼠抒跬：头血再藿注后羲血型艟蓬病雯防治作雨的实验碍宅 硫辛酸对肝缺血弭灌注损伤后缺血掣H|{道病变的防治作用，国内外文献尚未见报道。本 研究课题在犬鼠全肝缺血冉灌注模型的丛础上，以胆小管F-actin微丝为研究靶点，以伽 硫辛酸为干预措施，结合血清淤胆指标，研究肝缺血再灌注后胴小管F-actin微丝的变 化以及小硫辛酸在肝缺血再灌注损伤中埘肌小管F．actin微丝是否具有保护作用，以期 探讨a·硫辛酸在预防肝缺血再灌注后缺血型胆道病变发生的保护机制，为防治肝缺血再 灌注后缺血型胆道病变提供理论依据及新的途径，为洳硫辛酸应用于临床，提供事实及 理论依据。 l 材料与方法 1．1 材料：雄性SD大鼠90只，体重200～2509，西安交通大学医学院实验动 物中心提供。异硫氢胍荧光索标记的鬼笔环肽(FITC--Phalloidin)和抗荧光衰减 由西安交通大学医学院电子显微镜中心提供。激光共聚焦显微镜(型号：TCS Sp2)由西安交通大学医学院中心实验室提供。 I．2 方法 1．2．1实验分组 90只大鼠随机分成3组，每组30只。(1)对照组(N组)： 术中只开腹解剖肝门，不做肝门阻断及再灌注，直接取材； (2)缺血再灌注组 (I瓜组)：肝门阻断35min后再灌注；(3)12-硫辛酸处理组(LA组)。每组 30只，并按I／R不同时相分为缺血再灌注2h、6h、24h三个亚组，每个亚组各 10只。 l。2．2动物模型及取材 大鼠术前12h禁食，自由饮水。3％戊巴比妥钠 (30mg／kg)腹腔注射麻醉，取上腹正中切口入腹，游离肝蒂，用无创血管夹夹 闭，造成100％实质性肝缺血，持续时间为35min，后去除血管夹，形成再灌注。 N组仅开腹解剖肝门，不做肝血流阻断及再灌注。LA组于缺血前15min腹腔注 射a·硫辛酸(12-硫辛酸于注射前溶于载体(成分：乙醇35％，聚乙二醇40035％， O．9％盐水30％))，剂量100mg／kg。N组和I／R组于相应时点注入等量宅白载 体。至预定时点取材，心腔采血，制备血清。迅速切取肝脏组织，部分低温下细 切为!mm3大小，2．5％戊二醛固定，备电镜标本；部分用冰生理盐水洗去血迹、 拭干，快速置入冻存管，于液氮罐冷冻后移入一80℃冰箱保存，待F．actin检测： 部分置10％甲醛保存。 I．2．3检测指标 (1)血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶 检查：肝组织石蜡标本HE染色，光镜下观察肝组织病理改变；透射电镜观察毛 细胆管超微结构改变。(3)F．actin检测pJ：①将一80℃冰箱保存的肝脏组织于低 温切片机(一28℃)下切成8pm厚的冰冻切片；②PBS简单冲洗、晾干，用 3．7％的多聚甲醛于室温下固定10min，PBS洗3次；③以下步骤避光操作。滴 PBS冲洗3次，每次15min，洗玄多余荧光；④抗荧光衰减封片剂封片：⑤于 激光共聚焦显微镜下观察并采集图像，测定胆小管膜平均特异荧光强度。 1．2．4统计学处理实验数据采用平均数±标准差表示，用SPSSl3．0计算机统计软 件处理，各组问比较用方差分析、Dunnett—t检验，组问方差一i齐时采用非参数秩和检 验，P0．0．5有统计学意义。· 2 结果 2．I 各组血清ALT，AST、Y．GGT和TBIL水平的变化 血清ALT、AST水平，l爪各鲥【明显升高．再灌注6h组达最高，随后下降，和相 168 山东大学200dq-固雷际瑰代普通外稃进展学术会议 应时点N组比较均有显著性差异(P0．05)：LA组和I／R组比较明显下降，二者有显 著性差异(户0．05)，但仍高于N组(尸0．05)。(表1) 血清Y-GGT、IBIL水平，I／R各组明锓升高。均星持续升高趋势。和丰H应时点N 组比较均有显著性差异(pO．05)。LA各组和相应时点l爪组比较均明显下降，二者有 、 显著性差异(P0．05)，但仍高于N组(P0．05)。(表1)、 表1不同时点血清ALT、AST、Y_GGT和TBIL水平(x±J，n=lO) 注：木与N组比较PO．05；6与I／R组比较P0．05。 2．2 光镜下肝组织病理学改变 N组肝组织形态无明显变化，为正常肝组织形态学表现。肝小叶组织结构完整， 肝细胞板以中央静脉为中心向四周呈放射状排列。肝细胞胞质嗜酸红染，细胞核大形圆， 位于细胞中央，核膜清晰完整，核仁明显。l爪组肝组织轻度炎性反应，以再灌